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        復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物對大鼠高脂血癥和肝臟脂肪變性的影響

        2015-10-18 05:58:50楊建文劉亞男陳麗娜任曉亮戚愛棣
        中成藥 2015年3期
        關(guān)鍵詞:環(huán)糊精變性高脂血癥

        楊建文, 劉亞男, 高 杰, 陳麗娜, 任曉亮, 戚愛棣

        (天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津 300193)

        復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物對大鼠高脂血癥和肝臟脂肪變性的影響

        楊建文, 劉亞男, 高 杰, 陳麗娜, 任曉亮*, 戚愛棣

        (天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,天津300193)

        目的 觀察復(fù)方血脂寧的β-環(huán)糊精提取物對大鼠高脂血癥和肝臟脂肪變性的防治作用。方法 建立SD大鼠高脂血癥模型,采用分組灌胃給藥,8周后分別觀察復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物與傳統(tǒng)水提物對其血脂和肝臟脂肪變性防治作用。結(jié)果 血脂寧的環(huán)糊精提取物組和傳統(tǒng)水提物組均能降低大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和肝組織丙二醛水平,升高血清高密度脂蛋白膽固醇和肝組織超氧化物歧化酶水平,具有改善高脂血癥大鼠血脂指標(biāo)和肝臟脂肪變性的作用,且環(huán)糊精提取物組具有相對更加明顯的改善作用。結(jié)論 血脂寧的不同提取物對大鼠高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥和肝臟脂肪變性有防治作用,且β-環(huán)糊精提取物效果優(yōu)于傳統(tǒng)提取物。

        高脂血癥;肝臟脂肪變性;血脂寧;環(huán)糊精提取物

        高脂血癥(hyperlipidemia,HLP)又稱脂質(zhì)代謝紊亂或異常,是指由于脂質(zhì)代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常而導(dǎo)致血漿中總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇及甘油三脂中一種或多種脂質(zhì)水平超過正常范圍高限的病癥。高脂血癥可以誘導(dǎo)產(chǎn)生肝脂肪變性,重度肝脂肪變性稱為脂肪肝,可引起肝腫大、痛壓和肝功能異常。中藥制劑血脂寧丸收載于《中國藥典》2010年版一部中,由制首烏、決明子、荷葉、山楂等四味藥組成,具有化濁降脂、潤腸通便的功效,適用于痰濁阻滯型高脂血癥?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,血脂寧丸中降脂保肝的主要成分為:何首烏中的二苯乙烯苷和大黃素;決明子中的總蒽醌類成分;荷葉中的荷葉堿以及黃酮類成分槲皮素;山楂中的山楂黃酮。然而這些成分均存在不同程度水溶性差以及不穩(wěn)定等缺點(diǎn),使其提取以及利用受限。環(huán)糊精(cyclodextrin,簡稱CD)是一種由淀粉經(jīng)過酶解后形成的具有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的淀粉衍生物,具有簡單易得、廉價、應(yīng)用廣泛、生物毒性低、水溶性好等特點(diǎn),可與多種藥物分子包合形成復(fù)合物,增加藥物的溶解性[1]、穩(wěn)定性[2],提高提取效率[3-8]。本實(shí)驗(yàn)以血脂寧丸為基礎(chǔ)研究復(fù)方血脂寧的環(huán)糊精提取物對高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠高脂血癥和肝脂肪變性的影響,為今后臨床應(yīng)用血脂寧治療高脂血癥以及環(huán)糊精在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為中藥復(fù)方提取及制劑工藝的研究開發(fā)提供新的方法和思路。

        1 材料

        1.1實(shí)驗(yàn)動物 雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,SPF級,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2009-0004。

        1.2儀器 7020全自動生化分析儀(日本株式會社日文高新技術(shù));EnSpire酶標(biāo)儀(上海珀金埃爾默儀器有限公司PerkinElmer);TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯,BX41);2-16A高速臺式離心機(jī)(東菀市塘廈鑫磊儀器廠);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);JMF-320多級閃蒸器(金鼎科技儀器有限公司)。

        1.3主要試劑與試藥 β-環(huán)糊精(孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司);0.9%生理鹽水;冰醋酸,分析純;10%中性甲醛溶液;石蠟;蘇木素-伊紅染色劑(hematoxylin and eosin,HE);水為超純水。

        血清總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒均由北京中生北控生物科技股份有限公司研究生產(chǎn),批號121431;丙二醛(MDA)試劑盒,總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量試劑盒購自天津原平皓生物技術(shù)有限公司。

        1.4高脂飼料 72.8%普通飼料+10%豬油+10%糖+ 2%膽固醇+5%蛋黃+0.2%膽堿。

        1.5復(fù)方血脂寧的制備 藥材決明子(產(chǎn)地:河北)、制首烏(產(chǎn)地:四川)、荷葉(產(chǎn)地:河北)、山楂(產(chǎn)地:河北)購于安國市長安中藥材有限公司,經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)李天祥教授鑒定分別為決明Cassia obtusifolia的種子、何首烏Polygonum multif lorum Thunb的塊根、蓮Nelumbo nucifera Gaertn的葉、山楂Crataegus pinnatifida Bge.的果實(shí)。標(biāo)本存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院。

        血脂寧的傳統(tǒng)水提物制備方法:稱取生藥決明子72 g、制何首烏48 g、荷葉36 g、山楂24 g,加蒸餾水4 500 mL,冷浸1 h后,加熱煮沸后回流2 h,傾出濾液,同法回流提取3次,合并濾液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至270 mL,放入冰箱備用。

        血脂寧的環(huán)糊精提取物制備方法:稱取生藥決明子72 g、制何首烏48 g、荷葉36 g、山楂24 g,加含有9 gβ-環(huán)糊精的蒸餾水4 500 mL,冷浸1 h后,加熱煮沸后回流2 h,傾出濾液,同法回流提取3次,合并濾液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至270 mL,放入冰箱備用。

        2 方法

        2.1動物飼養(yǎng)與造模 SD大鼠先用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,環(huán)境溫度20~24℃,光照時間8∶00~18∶00。然后隨機(jī)取其中8只大鼠作為正常對照組大鼠,以普通飼料飼養(yǎng),其余大鼠以高脂飼料不限量飼養(yǎng)(高脂飼料組)。8周后將所有大鼠眼眶取血,3 000 r/min離心10 min后取上清液制備血清,結(jié)合測定試劑盒使用全自動生化分析儀測定血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST水平,從正常對照組與高脂飼料組中分別隨機(jī)處死3只大鼠確定模型成立。

        2.2動物給藥 造模成功后遂以隨機(jī)數(shù)字表法將其余高脂飼料組大鼠分為模型對照組、傳統(tǒng)水提物組、環(huán)糊精提取物組,分別以生理鹽水、血脂寧的傳統(tǒng)水提物、血脂寧的環(huán)糊精提取物灌胃,其中后兩組給藥量按臨床給藥劑量換算得到并由同樣量的處方提取所得,為6.75 g/(kg·d)。正常對照組以生理鹽水灌胃,持續(xù)灌胃8周。

        2.3實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測定

        2.3.1一般情況 實(shí)驗(yàn)期間每周稱體質(zhì)量1次,觀察食欲行為、糞便、毛發(fā)及動物死亡情況。

        2.3.2血清生化指標(biāo)的測定 灌胃給藥8周后,各組小鼠禁食不禁水12 h,眼眶取血,分離血清。血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST量的測定在全自動生化分析儀上進(jìn)行。

        2.3.3體質(zhì)量、肝濕重測定 灌胃給藥8周后,處死各組大鼠,稱量體質(zhì)量,迅速摘取整個肝臟,用0.9%生理鹽水沖洗,用濾紙吸干表面水分后稱量肝濕質(zhì)量,計(jì)算肝臟指數(shù)(liver index,LI,LI=肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%)。

        2.3.4肝組織勻漿的制備及肝勻漿指標(biāo)的測定 稱取大鼠肝組織200 mg,加冰的生理鹽水1.8 mL(1∶9,m/V)后用組織勻漿器于4℃勻漿8 min,2 000 r/min離心15 min后取上清液,得到10%肝組織勻漿,按試劑盒方法分別測定肝組織勻漿中的MDA水平以及SOD活性。肝組織勻漿中蛋白濃度根據(jù)BCA蛋白測定試劑盒說明書測定。

        2.3.5肝臟病理學(xué)改變 灌胃給藥8周后取肝臟作肉眼觀察,并作病理學(xué)檢查,觀察各組大鼠肝臟發(fā)生脂肪變性的情況。肝組織經(jīng)10%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片,進(jìn)行HE染色,光鏡下評估。

        評估的標(biāo)準(zhǔn) 病理科醫(yī)生對切片染色結(jié)果按LEE[9]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法評分。根據(jù)肝細(xì)胞含脂肪量將脂肪變性評分為0~4分(無,0分;≤25%,1分;25%~50%,2分;50%~75%,3分;≥75%,4分);每低倍視野下壞死灶數(shù)評價炎癥程度(無,0分;l個病灶,1分;2個以上病灶,2分;橋接或融合性壞死,3分);纖維化程度(無,0分;灶性或不完全性非橋接纖維化,≤50%肝小葉,1分;廣泛非橋接纖維化,>50%肝小葉,2分;橋接纖化,3分;肝硬化,4分)。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

        應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有數(shù)據(jù)均用(±s)來表示。計(jì)量資料各組數(shù)據(jù)間比較用單因數(shù)方差分析,然后用LSD法進(jìn)行兩兩比較;兩均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用Kruskal-Wallis和Mann-Whitney法多樣本比較秩和檢驗(yàn)。P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表1 血脂寧提取物對高脂血癥大鼠血脂的影響(±s)

        表1 血脂寧提取物對高脂血癥大鼠血脂的影響(±s)

        注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與傳統(tǒng)水提取物組比較,△P<0.05,△△P<0.01

        組別動物數(shù)TC/(mmol·L-1)TG/(mmol·L-1)LDL-C/(mmol·L-1)HDL-C/(mmol·L-1)ALT/(U·L-1)AST/(U·L-1)正常對照組5 1.37±0.17 0.60±0.18 0.24±0.12 1.15±0.19 33.20±5.54 147.2±16.21模型對照組5 2.01±0.10##0.98±0.08##0.57±0.16##0.85±0.04##53.00±5.43##149.4±7.77傳統(tǒng)水提物組5 1.82±0.16*0.84±0.04*0.37±0.04*1.00±0.05*45.00±4.58*130.6±14.62環(huán)糊精提取物組5 1.63±0.09**0.70±0.02**0.58±0.08 1.01±0.03*38.80±0.84**154.20±16.65△

        4 結(jié)果

        4.1一般情況 給藥后期個別大鼠有輕微腹瀉現(xiàn)象,其余大鼠生長發(fā)育良好,無意外死亡。與正常對照組相比較,模型對照組大鼠活動少,食欲下降,體質(zhì)量增加,尿色黃,大便較軟,部分大鼠有腹瀉現(xiàn)象;血脂寧提取物組大鼠狀態(tài)好于模型對照組。

        4.2復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物對高脂血癥大鼠血脂的影響

        如表1所示,造模后測得模型對照組大鼠血清指標(biāo)中除AST值外,其他指標(biāo)值均與正常對照組有顯著性差異,其中TC、TG、LDL-C、ALT值高于正常對照組,HDL-C值低于正常對照組;除AST外,傳統(tǒng)水提物組大鼠血清的其他指標(biāo)值均與模型對照組有差異(P<0.05),其中TC、TG、LDL-C、ALT值低于模型對照組,HDL-C值高于模型對照組,而AST值低于模型對照組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);環(huán)糊精提取物組大鼠的血清中TC、TG值顯著低于模型對照組,HDL-C值高于模型對照組,ALT值低于模型對照組,TC、TG、LDL-C、ALT、AST值與傳統(tǒng)提取物組有差異(P<0.05)。由此表明血脂寧的環(huán)糊精提取物較傳統(tǒng)水提物對高脂血癥大鼠的降脂作用有更好的效果。

        4.3復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響 模型組大鼠肝指數(shù)顯著高于正常組,傳統(tǒng)水提物組、環(huán)糊精組與模型組相比,大鼠肝指數(shù)較后者有顯著性差異(P<0.05)(見表2)。

        表2 血脂寧提取物對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s)

        表2 血脂寧提取物對高脂血癥大鼠肝臟指數(shù)的影響(±s)

        注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與傳統(tǒng)水提取物組比較,△P<0.05,△△P<0.01

        組別動物數(shù)體質(zhì)量/g肝臟濕質(zhì)量/g肝指數(shù)/%正常對照組5 575.4±45.18 13.16±1.36 2.28±0.12模型對照組5 601.0±43.71 18.52±1.69##3.08±0.09##傳統(tǒng)水提物組5 598.4±47.70 16.91±2.24 2.82±0.21*環(huán)糊精提取物組5 560.4±65.16 14.40±1.83**△2.57±0.23**△

        4.4復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物對高脂血癥大鼠肝臟脂肪變性的影響 正常對照組大鼠肝臟灰褐色,切面灰紅;模型對照組大鼠肝臟灰白,灰黃區(qū)域呈網(wǎng)狀分布,切面灰黃、紅黃相間;傳統(tǒng)水提物組大鼠肝臟灰黃、灰白,灰黃區(qū)域呈網(wǎng)狀分布,切面灰黃、灰褐;環(huán)糊精提取物組大鼠肝臟灰黃、灰褐,切面紅黃相間、實(shí)性、質(zhì)中(見圖1)。

        圖1 血脂寧提取物對大鼠肝臟的影響

        4.5復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物對高脂血癥大鼠肝組織形態(tài)的影響正常對照組大鼠肝臟基本結(jié)構(gòu)存在,小葉結(jié)構(gòu)清晰,無明顯界板炎,肝細(xì)胞索排列規(guī)則,未見明顯纖維化及炎細(xì)胞浸潤;模型對照組大鼠肝臟2、3區(qū)肝細(xì)胞重度脂肪變性,以小、中泡混合型為主,匯管區(qū)可見輕度纖維化;傳統(tǒng)水提物組大鼠肝臟基本結(jié)構(gòu)存在,小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞2、3區(qū)中度脂肪變性,小泡型為主,伴輕度纖維化;環(huán)糊精提取物組大鼠肝臟基本結(jié)構(gòu)存在,小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞2、3區(qū)輕度脂肪變性,以小泡型為主,未見明顯纖維化(見圖2)。由此可見模型對照組肝脂肪變性較為嚴(yán)重,傳統(tǒng)水提物組大鼠肝脂肪變性較模型對照組稍有減輕,環(huán)糊精提取物組大鼠肝脂肪變性較模型對照組、傳統(tǒng)水提物組大鼠有所減輕。

        圖2 血脂寧提取物對高血脂癥大鼠肝臟脂肪變性的影響

        肝組織病理學(xué)評分結(jié)果如下,模型組大鼠三項(xiàng)指標(biāo)評分均高于正常組,傳統(tǒng)水提物組和環(huán)糊精提取物組大鼠三項(xiàng)指標(biāo)較模型組均降低,其中脂肪變性評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而炎癥壞死與纖維化評分有降低趨勢,但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3)。

        表3 環(huán)糊精提取物對高脂血癥大鼠肝臟組織學(xué)的影響(±s)

        表3 環(huán)糊精提取物對高脂血癥大鼠肝臟組織學(xué)的影響(±s)

        注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

        組別n組織學(xué)變化程度脂肪變性炎癥壞死纖維化正常對照組5 1.8±0.45 1.0±0.71 0.2±0.45 5 1.0±0.00 0.8±0.45 0.0±0.00模型對照組5 2.2±0.45##1.4±0.55 0.6±0.55#傳統(tǒng)水提物組5 2.0±0.00**1.2±0.48 0.4±0.55環(huán)糊精提取物組

        4.6復(fù)方血脂寧環(huán)糊精提取物對高脂血癥大鼠肝臟SOD活性、組織MDA水平變化的影響 模型對照組大鼠肝組織的MDA值顯著高于正常組,SOD值顯著低于正常組(P<0.05);傳統(tǒng)水提物組以及環(huán)糊精提取物組大鼠肝組織的MDA值顯著低于模型組,SOD值高于模型對照組(P<0.05);環(huán)糊精提取物組大鼠肝組織較傳統(tǒng)水提物組MDA值有降低趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(見表4)。

        表4 血脂寧提取物對高脂血癥大鼠肝臟組織MDA水平、SOD活性的影響(±s)

        表4 血脂寧提取物對高脂血癥大鼠肝臟組織MDA水平、SOD活性的影響(±s)

        注:與對照組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

        組別動物數(shù)MDA/(nmol·mgprot-1)SOD/(U·mgprot-1)正常對照組5 1.11±0.14 173.37±24.40模型對照組5 2.26±0.51##134.56±16.65##傳統(tǒng)水提物組5 1.21±0.08**168.69±15.30**環(huán)糊精提取物組5 1.11±0.04**163.06±11.17*

        5 討論

        長期攝入高脂食物,脂肪吸收增加,TG和膽固醇合成超過其運(yùn)轉(zhuǎn),在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積,形成高脂血癥和肝脂肪變性。本實(shí)驗(yàn)以單純高脂飲食誘導(dǎo)大鼠高脂血癥模型,從該實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看用此方法造模8周后模型大鼠血清TG、TC等值高于正常組,HE染色結(jié)構(gòu)顯示模型大鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂肪變性,但血清AST值與正常組大鼠相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示該模型尚處于單純性肝脂肪病變階段。

        通過單因素考察與正交試驗(yàn),以復(fù)方血脂寧主要活性成分的提取率為評價指標(biāo),確定血脂寧環(huán)糊精提取物的最佳提取工藝為:稱取決明子72 g、制何首烏48 g、荷葉36 g、山楂24 g,加蒸餾水4 500 mL,冷浸1 h后,加熱煮沸后回流2 h,傾出濾液,同法回流提取3次后合并濾液。

        經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí),與傳統(tǒng)水提取物組相比,血脂寧的環(huán)糊精提取物組大鼠肝指數(shù)、血清中TG、TC、HDL-C、ALT指標(biāo)以及肝組織中MDA、SOD均有所改善,血脂寧的環(huán)糊精提取物較傳統(tǒng)水提取物對高脂血癥以及肝脂肪變性有更顯著的防治作用,分析其原因可能是:β-環(huán)糊精對血脂寧中主要降脂成分萘駢吡喃酮糖苷類、二苯乙烯苷類、蒽醌類、生物堿類以及黃酮類等成分具有良好包和作用,通過增加難溶性成分如大黃素等蒽醌類、荷葉堿等生物堿類以及槲皮素[10]等黃酮類化合物的溶解度,提高不穩(wěn)定性成分如槲皮素、大黃素、紅鐮霉素-6-O-β-D-龍膽二糖苷、二苯乙烯苷[11-13]、荷葉堿等化合物的穩(wěn)定性兩方面提高化合物的提取轉(zhuǎn)移率;給藥后環(huán)糊精的包合作用還可以促進(jìn)有效成分的吸收[14],提高血脂寧中活性成分的生物利用度,最終表現(xiàn)為提高了血脂寧治療高脂血癥的療效。

        經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí),血脂寧的環(huán)糊精提取物較傳統(tǒng)提取物對肝脂肪變性有更顯著的防治作用,為今后臨床合理應(yīng)用復(fù)方血脂寧治療高脂血癥、改善肝脂肪變性的應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)[15],為其他中藥及復(fù)方的β-CD包合提取提供參考,為環(huán)糊精在中藥領(lǐng)域的進(jìn)一步研究與研發(fā)提供基礎(chǔ)。

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        R285.5

        B

        1001-1528(2015)03-0649-05

        10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.043

        2014-01-19

        國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81473543)

        楊建文(1987—),男,碩士生,研究方向?yàn)樗幬锓治?。Tel:15620601460,E-mail:tom jiwen@126.com

        任曉亮,男,講師,研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)及藥物分析。Tel:(022)59596221,E-mail:xiaoliang_ren@sina.com

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