王 昕， 楊建英， 靳素琴， 吳華清

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院信息工程學(xué)院，甘肅　蘭州　730000；2.甘肅省疾控中心體檢中心，甘肅　蘭州　730000）

胡藍降糖緩釋片影響糖尿病腎病模型大鼠蛋白激酶A與蛋白激酶C活性的實驗研究

王 昕1， 楊建英2*， 靳素琴2， 吳華清2

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院信息工程學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.甘肅省疾控中心體檢中心，甘肅蘭州730000）

目的 觀察胡藍降糖緩釋片對糖尿病腎?。―N）模型大鼠的治療作用，檢測它對腎臟功能、細胞中蛋白激酶A（PKA）以及蛋白激酶C（PKC）活性的影響，探討胡藍降糖緩釋片對DN大鼠腎臟治療作用的可能機制。方法 采用單側(cè)腎臟切除聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）的方法制備DN大鼠模型；隨機分組，分期檢測各組大鼠空腹血糖（FBG）、尿微量白蛋白（mALB），測定大鼠腎皮質(zhì)細胞中PKA、PKC活性。結(jié)果 胡藍降糖緩釋片降低了DN大鼠FBG、24 h-mALB的水平，抑制了PKA、PKC的活化度，腎臟功能得到一定程度的恢復(fù)。結(jié)論 胡藍降糖緩釋片通過抑制PKA與PKC活化表達度，從而對DN大鼠腎臟起到一定的保護作用。

胡藍降糖緩釋片；糖尿病腎?。坏鞍准っ窤；蛋白激酶C；實驗研究

胡藍降糖緩釋片主要成分從葫蘆巴和絞股藍中提取，在臨床應(yīng)用過程中，對治療糖尿病腎?。―N）取得了很好的療效。為闡明其藥理作用機理，根據(jù)蛋白激酶在腎病理變化過程中的機制理論，設(shè)計了胡藍降糖緩釋片對DN模型大鼠作用的實驗，以期從PKA、PKC兩種激酶的角度出發(fā)，論證胡藍降糖緩釋片治療DN的藥理作用機制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與設(shè)備 流式細胞儀，血糖儀，PKA、PKC試劑盒，胡藍降糖緩釋片。鏈脲佐菌素（STZ）購自Sigma公司；兔抗大鼠結(jié)締組織生長因子（CTGF）多克隆抗體及SP免疫試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。蛋白激酶C（PKC）測定試劑盒購自Gibco公司。

1.1.2實驗動物 SPF級雄性（雄性大鼠制造模型的成模率明顯高于雌性大鼠）SD大鼠60只（動物合格證號001625），體質(zhì)量（200±20）g。

1.1.3造模劑 配置鏈脲佐菌素（STZ）液：檸檬酸緩沖液的配制：檸檬酸2.1 g加入蒸餾水100 mL配成A液；檸檬酸鈉2.9 g加入蒸餾水100 mL配成B液。用時A、B液按1∶1的比例混合，pH計測定pH值，調(diào)節(jié)pH 4.2～4.5，配置成STZ檸檬酸緩沖液。注射時以0.1 g/L檸檬酸緩沖液溶解STZ，按空腹體質(zhì)量注射相應(yīng)的STZ，在30 min內(nèi)注射完畢。

高脂糖飼料：基礎(chǔ)鼠飼料加蔗糖、煉豬油以及蛋黃，按比例搭配制作高脂高糖飼料，比例為豬油15%，蔗糖20%，蛋黃4%，基礎(chǔ)飼料60%［1］。

1.2造模預(yù)實驗 取大鼠10只，麻醉后做左側(cè)腎臟切除術(shù)，術(shù)后恢復(fù)2周。給藥前禁食12 h，以60 mg/kg的劑量，腹腔內(nèi)注射0.1 g/L的STZ液。給予高熱量飼料喂養(yǎng)。5 d后測定空腹血糖，以16.7 mmol/L作為DN大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。

1.3分組與給藥 40只大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、藥物對照組（艾塞那肽組）、給藥組（胡藍降糖緩釋片組），后3組按預(yù)實驗可行方案造模。藥物對照組給予艾塞那肽注射液，劑量為0.9μg/kg，皮下注射。給藥組給予胡藍降糖緩釋片稀釋液，給藥以灌胃方式進行，劑量為0.15 g/kg，濃度以給藥液體量2 mL為標(biāo)準(zhǔn)?？瞻讓φ战M與模型對照組正常飼養(yǎng)，不給予特殊處理。6周后采集標(biāo)本檢測實驗數(shù)據(jù)。

1.4實驗處理

1.4.1空腹血糖（FBG）測定 分別于造模前、注射STZ 5 d后、給藥6周末，尾靜脈取血，使用血糖儀測定空腹血糖。

1.4.2尿微量白蛋白（mALB）測定 造模前留取尿液標(biāo)本，應(yīng)用大鼠尿微量白蛋白放射性免疫分析試劑盒檢測尿蛋白水平；取尿液標(biāo)本，檢測尿蛋白水平。

1.4.3腎皮質(zhì)細胞PKA、PKC活性測定 腎皮質(zhì)細胞胞液和膜成分的分離：分離腎皮質(zhì)，每100 mg腎皮質(zhì)組織加入110 mL緩沖液1（20 mmol/L Tris、0.5 mmol/L EGTA、0.5 mmol/L EDTA、10 mmol/L B-巰基乙醇、0102 5 mg/mL牛胰蛋白酶抑制劑、0102 5 mg/mL亮抑蛋白肽，pH7.5），在冰上充分勻漿，勻漿液于4℃、2 000×g離心15 min，棄沉淀物（去除細胞核、未破碎的細胞及組織）。再于4℃、10 000×g離心60 min，上清液即為胞液成分，用于檢測胞液PKC活性。于冰浴中沉淀物用緩沖液2（含015%Triton X-100的緩沖液1，pH 7.5）勻漿，勻漿液于4℃、2 000× g離心15 min，所得上清液即為去污劑溶解的膜制劑，用于檢測胞膜PKC活性［1］。

取腎皮質(zhì)細胞胞液和胞膜制備劑分別用Lowry法進行蛋白定量后，采用PKC試劑盒方法測定胞液和胞膜中PKC活性，底物采用髓鞘堿性蛋白肽MBP4214，PKA、PKC活性以單位時間內(nèi)每1 mg蛋白質(zhì)催化ATP的pmoL數(shù)表示。

1.5數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析，組間差別的兩兩比較使用q檢驗。

2　結(jié)果

2.1胡藍降糖緩釋片對DN大鼠FBG的影響 與造模前相比，造模后除空白對照組外，各模型組FBG顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。給藥6周后，與模型組比較，艾塞那肽組FBG水平顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），胡藍降糖片組也呈顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠FBG的影響（±s）

表1　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠FBG的影響（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.05

組別動物數(shù)給藥劑量FBG/（mmoL·L-1）造模前造模后5 d給藥后6周空白對照組10—5.6±1.2 5.8±1.0 4.9±1.6模型對照組10—5.1±1.6 19.3±3.2**18.7±3.2艾塞那肽組10 0.9μg·kg-14.9±1.3 20.4±5.1**11.0±6.5▲胡藍降糖片組10 0.15 g·kg-14.2±2.4 19.2±4.7**12.6±6.0▲

2.2胡藍降糖緩釋片對DN大鼠尿液24 h-mALB的影響與造模前相比，造模后除空白對照組外，各模型組24 hmALB顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型對照組與藥物治療組數(shù)據(jù)分析顯示無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥6周后，與模型對照組比較，艾塞那肽組24 h-mALB水平顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；胡藍降糖片組24 h-mALB水平也顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與艾塞那肽組比較，胡藍降糖片組在降低實驗大鼠24 hmALB水平方面作用較弱，兩種藥物治療后獲取的數(shù)據(jù)存在差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠尿液24h-m ALB的影響（±s）

表2　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠尿液24h-m ALB的影響（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，▲▲P＜0.01；▲P＜0.05

組別動物數(shù)給藥劑量24 h-mALB/ng造模前造模后給藥后6周空白對照組10—92.82±32.42 92.82±32.15 114.71±31.11模型對照組10—98.13±33.35 985.14±115.47**953.11±133.76艾塞那肽組10 0.9μg·kg-190.85±33.26 890.58±130.31**449.57±167.50▲▲胡藍降糖片組10 0.15g·kg-187.23±29.9 1 043.11±123.82**661.80±69.13▲

2.3胡藍降糖緩釋片對DN大鼠PKA活性的影響 與造模前相比，造模后除空白對照組外，各模型組PKA水平顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型對照組與藥物治療組相互之間，數(shù)據(jù)分析顯示無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥6周后，與模型對照組比較，艾塞那肽組與胡藍降糖片組PKA水平顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而兩給藥組PKA水平數(shù)據(jù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠腎皮質(zhì)細胞PKA的影響（±s）

表3　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠腎皮質(zhì)細胞PKA的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，▲P＜0.05

組別動物數(shù)給藥劑量PKA/（pmol·min-1·mg-1）造模前造模后給藥后6周空白對照組10—617.6±43.1 625.4±41.8 622.6±56.3模型對照組10—626.7±52.4 853.3±57.6*836.9±34.7艾塞那肽組10 0.9μg·kg-1624.8±44.3 821.1±48.2*499.7±43.2▲胡藍降糖片組10 0.15 g·kg-1611.2±54.4 819.4±49.5*509.4±55.2▲

2.4胡藍降糖緩釋片對DN大鼠PKC活性的影響 與造模前相比，造模后除空白對照組外，各模型組PKC水平顯著升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；模型對照組與藥物治療組相互之間，數(shù)據(jù)分析顯示無統(tǒng)計學(xué)意義。給藥6周后，與模型對照組比較，艾塞那肽組與胡藍降糖片組PKC水平顯著降低，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而兩給藥組PKC水平數(shù)據(jù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠腎皮質(zhì)細胞PKC的影響（±s）

表4　胡藍降糖緩釋片對DN大鼠腎皮質(zhì)細胞PKC的影響（±s）

注：與空白對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.05

組別動物數(shù)給藥劑量PKC/（pmol·min-1·mg-1）造模前造模后給藥后6周空白對照組10—80.1±11.2 85.8±7.6 85.8±7.6模型對照組10—79.2±8.4 368.7±24.9**376.7±36.8艾塞那肽組10 0.9μg·kg-184.1±9.5 375.4±41.5**231.6±15.7▲胡藍降糖片組10 0.15 g·kg-183.5±8.5 382.5±45.3**248.4±21.3▲

3　討論

研究顯示，糖尿病大鼠腎臟NOX4和p22phox mRNA表達水平顯著升高，導(dǎo)致糖尿病大鼠腎臟氧化應(yīng)激水平升高，作用于糖尿病大鼠腎臟而引起腎組織損傷，進一步導(dǎo)致腎臟結(jié)締組織生長因子（CTGF）蛋白表達增加，腎臟肥大指數(shù)和尿白蛋白增加，腎臟病理改變加重［2］。糖尿病情況下存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)增強，參與氧化應(yīng)激機制的因素很多，PKC處于被激活的狀態(tài)［3］。我們在研究胡藍降糖緩釋片藥理作用機制時，選擇PKA作為總的蛋白激酶活性的指標(biāo)；選擇PKC作為特異性較強的指標(biāo)，體現(xiàn)藥物作用下激酶反應(yīng)的明確指征。DN患者尿蛋白水平與血中PKC水平成正相關(guān)，動物試驗證實，PKC-β基因的敲出和利用雙吲哚基順丁烯二酰亞胺阻滯PKC相關(guān)信號通路，均可使DN動物免受腎臟肥大、腎小球高濾過、ECM沉積、結(jié)締組織生長因子（CTGF）、TGF-β1和活性氧生成所造成的危害［4］。PKC的激活與TGF-β1的生成，可以上調(diào)細胞黏附分子在腎小球系膜細胞中的表達和促進腎小球白細胞的浸潤，加速腎小球損傷［5］。

艾塞那肽是人工合成的GLP-1受體激動劑，通過與其受體特異性結(jié)合發(fā)揮作用［6］。是腸促胰素類似物藥物，可模擬人體自身胰高糖素樣肽1（GLP-1）的功能，降低健康受試者和2型糖尿病患者的體質(zhì)量、空腹和餐后血糖，降低糖化血紅蛋白，同時促進胰島β細胞新生、增殖，抑制β細胞凋亡，改善β細胞功能，促進胰島素分泌，增加機體對胰島素的敏感性［7］。可以作為很好的對照藥物應(yīng)用于實驗。

胡藍降糖緩釋片主要藥物是葫蘆巴和絞股藍。葫蘆巴苦、溫，歸腎經(jīng)，溫腎助陽、散寒止痛。鑒定出26種化合物，其中胺類、酸類、醇類、酯類、酮類，分別占揮發(fā)油含有量的0.54%、0.18%、66.32%、12.13%與0.61%［8］。絞股藍苦、微甘，性涼，歸肺、脾、腎經(jīng)；能益氣健脾、化痰止咳、清熱解毒，可降低血壓、血脂、血糖。絞股藍對2型糖尿病大鼠腎臟纖維化有保護作用，可能是通過下調(diào)大鼠腎組織TIMP-1和上調(diào)MMP-9的表達來實現(xiàn)的［9］。葫蘆巴聯(lián)合纈沙坦不但可明顯減少蛋白尿而且有助于控制血糖，可作為治療糖尿病腎病的一種選擇［10］。葫蘆巴和絞股藍配伍應(yīng)用于治療DN，藥物氣味入歸腎經(jīng)，在溫補腎氣的同時，清化痰瘀邪氣對腎臟的侵害。DN病理過程起因于血液糖濃度的增加，后因于高糖這種痰濁而導(dǎo)致腎臟氣血失暢，以致出現(xiàn)慢性勞損性腎臟功能的損害。針對這種病理特點，治療的出發(fā)點就應(yīng)該是補腎以促進腎臟功能的回復(fù)、化痰祛瘀以祛除病因?qū)δI臟的繼續(xù)損傷。從病理學(xué)方面說，就是要改善腎臟血流、減少尿蛋白，以及防治腎臟纖維化［11］。絞股藍健脾清氣化痰、葫蘆巴溫腎助陽，二者相合正好能適合治療特點的要求，所以在臨床上能有好的治療效果。

實驗顯示DN模型大鼠腎功能經(jīng)胡藍降糖緩釋片治療出現(xiàn)改善的狀態(tài)，而相對應(yīng)的腎皮質(zhì)細胞蛋白激酶的變化特點提示，胡藍降糖緩釋片可以影響到分子層面的藥理作用環(huán)節(jié)，而這種藥理作用途徑正是確認和有效把握藥物制劑臨床使用的可靠途徑。高糖條件下，PKC激活可以增加MC的NO產(chǎn)生，從而使血管擴張，腎血流增加，腎小球高濾過，導(dǎo)致早期DN［12］；細胞膜PKC活性增加，胞漿活性下降，提示高糖可引起腎小球細胞內(nèi)PKC由胞漿向胞膜移位活化［13］。通過影響DN大鼠腎組織分子的表達而改善生化指標(biāo)，減輕腎臟病理損害［14］，是實驗研究的方法性前提。實驗為胡藍降糖緩釋片治療DN藥理機制的闡釋鋪陳了一定的基礎(chǔ)。

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R285.5

B

1001-1528（2015）03-0637-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.039

2014-02-07

甘肅省中醫(yī)藥管理局科研項目（GZK-2012-59）

王 昕（1970—），男，講師，研究方向為中藥資源與質(zhì)量控制。Tel：（0931）8765365

楊建英（1965—），女，副檢驗師。Tel：（0931）8271733