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        HPLC法同時(shí)測(cè)定吉祥草中阿魏酸及蘆丁

        2015-10-18 05:58:40田源紅張永萍王建科
        中成藥 2015年3期
        關(guān)鍵詞:蘆丁吉祥磷酸

        田源紅, 張永萍, 李 瑋, 徐 劍, 王建科, 劉 赟

        (貴陽中醫(yī)學(xué)院,貴州 貴陽 550002)

        HPLC法同時(shí)測(cè)定吉祥草中阿魏酸及蘆丁

        田源紅, 張永萍*, 李 瑋, 徐 劍, 王建科, 劉 赟

        (貴陽中醫(yī)學(xué)院,貴州貴陽550002)

        目的 建立吉祥草中阿魏酸和蘆丁的測(cè)定方法。方法 采用反相高效液相色譜法,Wondasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水(38∶62),體積流量為1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;柱溫30℃。結(jié)果 阿魏酸在0.40~2.40μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.999 9),平均回收率為100.1%,RSD為2.8%;蘆丁在0.625~5.625μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r=0.999 95),平均回收率為100.7%,RSD為1.3%。結(jié)論 該方法分離效果好,操作簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性好,重復(fù)性好,可用于吉祥草中阿魏酸和蘆丁的測(cè)定。

        吉祥草;RP-HPLC;阿魏酸;蘆丁

        吉祥草又名觀音草,為百合科植物吉祥草Reineckia carner(Andr.)Kunth的干燥全草。具有滋陰潤(rùn)肺、涼血止血的功效,用于肺燥咳喘、陰虛咳嗽、咯血、遺精、跌撲損傷。在《本草綱目》、《中藥大辭典》、《全國中草藥匯編》中均有記載,苗族、侗族、布依族喜用鮮品治療咳嗽等[1-2]。是咳速停糖漿、咳速停膠囊、復(fù)方吉祥草片等制劑的主要藥物。近年來發(fā)現(xiàn)其中還含有Fe、Cu、Zn、Mn、Mg、Ca、K等8種微量元素,且含有量較高,具有較高的藥用價(jià)值[3]。還發(fā)現(xiàn)具有溶血、止咳、化痰、抗炎、降血糖的作用[4-5]。阿魏酸是抑菌作用的有效成分,蘆丁是止咳作用的有效成分[6],本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)兩成分定量測(cè)定方法進(jìn)行了研究,為提高吉祥草的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)。

        1 藥材

        吉祥草經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院汪毅教授鑒定為百合科植物吉祥草Reineckia carner(Andr.)Kunth的干燥全草。

        2 儀器與試藥

        2.1儀器 高效液相色譜儀(日本島津/LC-20AT)、超聲波清洗機(jī)(北京創(chuàng)新德超聲電子研究所)、SHZ-95型循環(huán)水式真空泵(河南鞏義市予華儀器有限公司)、AE-240雙量程電子分析天平(萬分之一,十萬分之一)、HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)、色譜柱(ACE C18、WondaSil C18、Diamonsil C18)。

        2.2試藥 阿魏酸對(duì)照品(貴州迪大生物科技有限責(zé)任公司,供含量測(cè)定用,批號(hào)1135-24-6),蘆丁對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所,供含量測(cè)定用,批號(hào)100080-200707),色譜甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20130501),娃哈哈純凈水,分析純甲醇、乙醇、磷酸。

        3 試驗(yàn)方法

        3.1對(duì)照品溶液的的制備 精密稱取阿魏酸對(duì)照品0.016 g,于100 mL量瓶中,用色譜甲醇定容至刻度,即得每1 mL含阿魏酸0.16 mg的溶液;另取蘆丁對(duì)照品0.025 g,于100 mL量瓶中,同法即得每1 mL含蘆丁0.25 mg的溶液。

        3.2供試品溶液的制備

        3.2.1提取方法考察 分別用超聲提取[7]、回流提?。?]、索氏提取,結(jié)果用回流提取的方法兩成分的峰面積最大,且分離度、拖尾因子較好,故選用回流提取。

        3.2.2正交試驗(yàn) 精密稱取吉祥草全草粉末約1 g于100 mL圓底燒瓶中,以料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)為四因素,各3個(gè)水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,9個(gè)樣品,回流提取,過濾,濾液水浴揮干,殘?jiān)佑? mL甲醇定容,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液,進(jìn)樣10μL。測(cè)定峰面積,計(jì)算。因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1~4。

        表1 因素水平Tab.1 Level of factors

        表2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of the experiment

        表3 阿魏酸方差分析Tab.3 Variance analysis of ferulic acid

        表4 蘆丁方差分析Tab.4 Variance analysis of rutin

        從表2得出:影響阿魏酸因素依次為C>D>B>A,最佳方案為A3B2C2D3;影響蘆丁因素依次為C>D>A>B,最佳方案為A2B3C3D3。提取時(shí)間、提取次數(shù)影響較大。

        從表3、4得出:料液比、甲醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)吉祥草中阿魏酸和蘆丁的量無顯著性差異。

        綜上所述,考慮到節(jié)約溶劑和時(shí)間,提取方案為A3B2C2D2,即:料液比(1∶30)、甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)(90%)、提取時(shí)間(1 h)、提取次數(shù)(2次)作為提取吉祥草的最佳提取條件。即:精密稱取吉祥草全草粉末約1 g于100 mL圓底燒瓶中,精密加入30 mL 90%甲醇回流提取1 h,過濾,濾液備用,再將濾紙放入圓底燒瓶中同法回流1 h,合并兩次濾液,水浴揮干,殘?jiān)佑? mL甲醇定容,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液作為供試品溶液,進(jìn)樣10μL。

        3.3色譜條件 WondaSilC18色譜柱(250 mm× 4.6 mm,5μm);流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水(32∶68);體積流量1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm;柱溫30℃。

        3.3.1色譜柱的選擇 分別對(duì)ACEC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、DiamonsilC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、WondaSilC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明,WondaSilC18柱(250 mm×4.6 mm,5μm)的色譜柱分離效果好,故選擇此色譜柱。

        3.3.2最大吸收波長(zhǎng)的選擇 對(duì)200~400波段進(jìn)行掃描,蘆丁在波長(zhǎng)365 nm處有最大吸收,阿魏酸在265 nm處有最大吸收波長(zhǎng)。通過實(shí)驗(yàn)比較選擇的最適吸收波長(zhǎng)為270 nm。

        3.3.3流動(dòng)相的選擇 先后對(duì)甲醇-0.4%磷酸水、甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.2%磷酸水、甲醇-0.3%磷酸水、甲醇-水、甲醇-水-乙酸(45∶54∶1)[9]6種流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇甲醇-0.4%磷酸水(32∶68)作為流動(dòng)相。

        3.4方法學(xué)考察

        3.4.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取質(zhì)量濃度為0.16 mg/mL的阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15μL注入高效液相色譜儀,記錄其峰面積,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),得回歸方程y=3×106x-29 728(r=0.999 9),結(jié)果表明阿魏酸在0.40~2.40μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系;同法精密量取質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.5、5.0、7.5、10、12.5、15、22.5μL注入高效液相色譜儀,記錄其峰面積。得出回歸方程y=2×106x-1 684.5(r=0.999 95),結(jié)果表明蘆丁在0.625~5.625μg范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。樣品、對(duì)照品HPLC圖譜見圖1。

        圖1 吉祥草HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of Reineckia carner

        3.4.2精密度試驗(yàn) 精密吸取按正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳提取工藝制備的供試品溶液,每次進(jìn)樣10 μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,測(cè)定峰面積,結(jié)果阿魏酸峰面積RSD為1.7%,蘆丁峰面積RSD為1.6%,結(jié)果表明儀器精密度良好。

        3.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一吉祥草樣品,每次進(jìn)樣10μL,分別于0、2、4、6、8、12 h依次進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,結(jié)果阿魏酸峰面積RSD為2.4%,蘆丁峰面積RSD為0.9%,結(jié)果表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

        3.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一吉祥草樣品粉末6份,每份約1 g,制備供試品溶液,每次進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積,計(jì)算,結(jié)果阿魏酸RSD為2.9%,蘆丁RSD為2.3%,表明該方法重復(fù)性良好。

        3.4.5回收率試驗(yàn) 分別稱取已知含有量吉祥草樣品粉末(阿魏酸0.119 mg/g和蘆丁0.425 mg/g)6份,每份約0.5 g,精密加入阿魏酸對(duì)照品(0.103 mg/mL)溶液0.6 mL和蘆丁對(duì)照品(0.220 mg/mL)溶液1 mL,按供試品項(xiàng)下制備,進(jìn)樣10μL,測(cè)定峰面積,計(jì)算,阿魏酸平均回收率為100.1%、RSD為2.8%,蘆丁的平均回收率為100.7%,RSD為1.3%,表明該方法的回收率良好。見表5,表6。

        表5 阿魏酸加樣回收率試驗(yàn)Tab.5 Results of recovery tests for ferulic acid

        表6 蘆丁加樣回收率試驗(yàn)Tab.6 Results of recovery tests for rutin

        3.4.6樣品測(cè)定 精密吸取3批吉祥草藥材的供試液10μL分別進(jìn)樣,記錄峰面積,計(jì)算阿魏酸和蘆丁的量,結(jié)果見表7。3批吉祥草中的阿魏酸含有量在0.011%~0.013%之間,蘆丁含有量在0.047%~0.054%之間。

        表7 阿魏酸、蘆丁測(cè)定結(jié)果Tab.7 Determ ination results of ferulic acid and rutin

        4 結(jié)果與討論

        4.1體積流量的選擇 分別對(duì)0.8、0.9、1.0 mL/min的體積流量進(jìn)行考察,結(jié)果表明1.0 mL/min時(shí)峰面積最大。

        4.2柱溫的選擇 分別對(duì)25℃[10]、30℃[11]、35℃[12]三個(gè)柱溫進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明30℃時(shí)峰型最佳,故選擇柱溫為30℃。

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        Determ ination of ferulic acid and rutin in Reineckia carner(Andr.)Kunth.by HPLC

        TIAN Yuan-hong, ZHANG Yong-ping, LIWei, XU Jian, WANG Jian-ke, LIU Yun
        (Guiyang College of Traditional Chinese Medicine,Guizhou 550002,China)

        Reineckia carner(Andr.)Kunth;RP-HPLC;ferulic acid;rutin

        R284.1

        A

        1001-1528(2015)03-0603-04

        10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.031

        2014-04-04

        貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目(黔科合重G字[2012]4 001號(hào));貴州省教育廳中藥、民族藥產(chǎn)地加工與炮制技術(shù)工程中心(黔教合KY字[2012]021號(hào))

        田源紅(1963—),女,教授,碩士生導(dǎo)師,從事中藥材民族藥材炮制工藝及質(zhì)量研究。Tel:13511931919,E-mail:tyh0831@sohu.com

        張永萍(1964—),女,教授,碩士生導(dǎo)師,從事中藥新制劑新劑型新技術(shù)研究。Tel:(0851)5652056,E-mail:zgygpg @sohu.com

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