紀(jì)其雄， 彭 昕*， 吳曉菁， 楊雄志

（1.浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校，浙江　寧波　315100；2.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司，浙江　紹興　312000）

三葉青相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系的建立與優(yōu)化

紀(jì)其雄1， 彭 昕1*， 吳曉菁2， 楊雄志1

（1.浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315100；2.太極集團(tuán)浙江東方制藥有限公司，浙江紹興312000）

目的 建立浙江和江西產(chǎn)的三葉青（Tetrastigma hemsleyanum）SRAP-PCR的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序。方法 應(yīng)用L9（34）正交設(shè)計(jì)方法，以三葉青基因組DNA為模板，研究了Mg2+、dNTP、引物和模板DNA 4種PCR反應(yīng)組分濃度變化對(duì)擴(kuò)增結(jié)果的影響，根據(jù)梯度PCR儀引物的條帶數(shù)量及清晰度選擇退火溫度。結(jié)果 優(yōu)化后的25μL反應(yīng)體系包含：10×PCR buffer2.5μL，2.5 mmol/LMgCl2，0.15 mmol/L dNTP，0.15μmol/L引物，1.0 U Taq DNA聚合酶，50 ng DNA模板。擴(kuò)增程序的最佳退火溫度為51℃。并篩選出8對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物豐富，多態(tài)性好的引物。結(jié)論 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的三葉青SRAP反應(yīng)體系，經(jīng)過10份樣品檢驗(yàn)，證明該體系穩(wěn)定可靠，多態(tài)性好，可用于三葉青遺傳多樣性分析。

三葉青；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（SRAP-PCR）；正交設(shè)計(jì)

三葉青Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg為葡萄科崖爬藤屬植物，是我國獨(dú)有的珍稀藥用植物，是抗腫瘤常用藥物［1-2］，也可用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝炎、高熱及病毒性腦膜炎等多種疾病。目前該植物野生資源瀕臨滅絕，其組培快繁技術(shù)雖有包括本課題組在內(nèi)的一些探索［3-6］，但技術(shù)尚不夠成熟，滿足不了臨床需求。用分子標(biāo)記的方法研究物種間親緣關(guān)系及種內(nèi)遺傳多樣性，可為品種鑒別、良種選育、基因資源保護(hù)與利用等提供科學(xué)依據(jù)。而三葉青遺傳多樣性的評(píng)價(jià)及DNA指紋圖譜建立方面尚未見報(bào)道。

目前使用最廣泛的DNA分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP、RAPD、ISSR、AFLP、SNP和SRAP等。其中SRAP標(biāo)記（sequence-related amplified polymorphism）是2001年由Li等［7］提出的基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種標(biāo)記?；驹硎抢锰厥獾囊镌O(shè)計(jì)方式實(shí)現(xiàn)對(duì)ORFs（開放閱讀框架）的擴(kuò)增，正向引物中的核心序列CCGG錨定ORF區(qū)的外顯子；反向引物中的核心序列AATT錨定內(nèi)含子與啟動(dòng)子。因不同個(gè)體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子及其間隔區(qū)長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性，從而擴(kuò)增出豐富的SRAP多態(tài)性標(biāo)記，具有多態(tài)性高，重復(fù)性好，操作簡單等特點(diǎn)，是一種比較理想的新型分子標(biāo)記。本研究擬對(duì)影響三葉青SRAP-PCR反應(yīng)體系的Mg2+，dNTP，模板DNA水平，TaqDNA聚合酶，引物濃度，退火溫度等因素進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，旨在建立適用于三葉青的SRAP-PCR反應(yīng)體系，為今后進(jìn)一步開展三葉青種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建和品種鑒定等工作奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1　材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所有試劑及合成引物均購自上海生工生物工程有限公司，10個(gè)SRAP正向引物和10個(gè)SRAP反向引物序列見表1。Eppendorf Master cycler梯度PCR儀（德國Eppendorf公司），Gel Doc XR +紫外凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司），高速冷凍離心機(jī)（杭州納德公司），Sub-Cell系統(tǒng)水平電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

表1　三葉青SRAP標(biāo)記分析的待選引物序列Tab.1 Primer sequence for SRAP analysis of T.hemsleyanum

本實(shí)驗(yàn)所采用的三葉青材料，其中編號(hào)zj1～zj6的采自浙江麗水，編號(hào)jx1～jx4的采自江西弋陽，經(jīng)麗水農(nóng)科院吉慶勇高級(jí)農(nóng)藝師和浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校楊雄志教授鑒定為Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg。

2　方法

2.1基因組DNA的提取與檢測 三葉青基因組DNA提取采用改良CTAB法［8］，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白檢測儀檢查總DNA濃度及其完整性，并用雙蒸水稀釋至50 ng/μL備用。

2.2SRAP-PCR擴(kuò)增程序及反應(yīng)體系 擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，（94℃40 s，40℃1 min，72℃1 min）5循環(huán)，（94℃40 s，50℃1 min，72℃1 min）35循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)含0.05%EB的2.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，電極緩沖液為1×TAE，電泳電壓5 V/cm，紫外凝膠成像分析儀內(nèi)觀察、拍照。原初擴(kuò)增反應(yīng)體系為：25μL PCR反應(yīng)，10×緩沖液2.5μL，2.5 mmol/L MgCl2，1U Taq酶，25 ng模板DNA，0.2 μmol/L引物，0.1 mmol/L dNTP。

2.3退火溫度的篩選 先根據(jù)原初的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行引物的初篩，選擇能看到清晰條帶的引物組合Me3和Em5對(duì)退火溫度進(jìn)行考察。

2.4SRAP-PCR反應(yīng)體系的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用L9（34）正交設(shè)計(jì)，對(duì)Mg2+、引物、dNTP和模板DNA進(jìn)行四因素三水平篩選，見表2，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，用Quantity one分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照特異性條帶強(qiáng)弱進(jìn)行處理，特異條帶強(qiáng)、清晰度高、背景低的記為9分，與之相反最差的記分為1，其他的與其相比取整數(shù)值，對(duì)其從高到低依次打分［9-10］。

表2　SRAP-PCR反應(yīng)L9（34）正交設(shè)計(jì)Tab.2 L9（34）orthogonal design for the factors and levels of SRAP-PCR reaction

2.5體系穩(wěn)定性和多態(tài)性驗(yàn)證 利用以上篩選出來的優(yōu)化擴(kuò)增條件對(duì)10份三葉青材料對(duì)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和多態(tài)性進(jìn)行驗(yàn)證，每個(gè)材料重復(fù)3次。

3　結(jié)果與分析

3.1退火溫度篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果 退火溫度過低可能引起引物與模板錯(cuò)配，非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，溫度過高引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降。由梯度PCR儀自動(dòng)生成的8個(gè)不同退火溫度對(duì)引物組合Me3和Em5擴(kuò)增結(jié)果的影響見圖1，從圖中可以看出，雖然各溫度均能擴(kuò)增出條帶，但條帶數(shù)量及清晰度有明顯區(qū)別，43～45.7℃時(shí)主要擴(kuò)增出分子質(zhì)量大的一些條帶，而且條帶較為彌散，53.8～56℃較高溫度時(shí)主要擴(kuò)增出分子質(zhì)量小的條帶，條帶清晰，但副帶逐漸減少，48.4～51℃時(shí)擴(kuò)增出的條帶數(shù)量最多而且條帶清晰度較高，考慮較高退火溫度有利于減少雜帶的產(chǎn)生，因此，選擇51℃為三葉青SRAP擴(kuò)增最佳退火溫度。

圖1　退火溫度對(duì)三葉青SRAP擴(kuò)增的影響Fig.1 Effect of annealing temperature on T.hemsleyanum SRAP amp lification

3.2正交試驗(yàn)結(jié)果 三葉青SRAP-PCR正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，表3和圖2。利用SPSS 17.0將上述記分結(jié)果進(jìn)行方差分析和多重比較分析，結(jié)果表明，Mg2+濃度、dNTP、引物濃度及模板DNA濃度均對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有顯著的影響（P＜0.05）。均方差顯示各因素對(duì)結(jié)果影響的主次順序?yàn)椋篋NA模板濃度＞Mg2+濃度＞引物濃度＞dNTPs，進(jìn)一步對(duì)各因素的不同水平進(jìn)行多重比較，見表4，Mg2+濃度三個(gè)水平之間差異均達(dá)到顯著水平，P值分別為0.000（1.5與2 mmol/L之間）、0.000（1.5與2.5 mmol/L之間）和0.003（2與2.5 mmol/L之間），結(jié)合表2中PCR結(jié)果均值可知2.5 mmol/L為最適合Mg2+濃度。引物濃度在0.25μmol/L與其它兩個(gè)水平之間有顯著差異，P值分別為0.001（0.15和0.25μmol/L之間）和0.000（0.2與0.25μmol/L之間）0.15和0.2μmol/L之間為0.069，沒有顯著差異，結(jié)合表4中不同處理水平結(jié)果均值可知引物0.15或0.2μmol/L均為較佳濃度，考慮成本確定引物最佳濃度為0.15μmol/L。0.15和0.25 mmol/L dNTP濃度之間沒有顯著差異（P值為0.139），結(jié)合表4中不同處理水平結(jié)果均值可知0.15 mmol/L為最適dNTP濃度。模板DNA濃度三個(gè)水平間均有顯著差異，P值分別為0.000（25與50，25與75），0.032（50和75之間），結(jié)合表4中不同處理水平結(jié)果均值可知50 ng為最適模板用量。綜上所述，Mg2+濃度2.5 mmol/L，引物濃度0.15μmol/L，dNTPs0.15mmol/L，DNA模板50 ng為三葉青SRAP-PCR的最佳反應(yīng)體系。

圖2　L9（34）正交設(shè)計(jì)SRAP擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Electrophoresis of L9（34）orthogonal design

表3　正交試驗(yàn)中各因素方差分析Tab.3 Analysis of variance for factors of orthogonal design

表4　各因素不同處理水平結(jié)果均值差異顯著性Tab.4 Significance among themeans of different factor levels

3.3引物篩選 在優(yōu)化PCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，以擴(kuò)增出的條帶清晰度高，多態(tài)性好，重復(fù)性好為原則，從100對(duì)引物中篩選出8對(duì)引物組合（表5）。

3.4體系穩(wěn)定性和多態(tài)性驗(yàn)證 從圖3可見，引物組合Me3和Em5可以10份種質(zhì)材料中擴(kuò)增出清晰度高、多態(tài)性較高、重復(fù)性好的DNA條帶。這表明經(jīng)過優(yōu)化后建立的SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠。

圖3　三葉青SRAP優(yōu)化體系的穩(wěn)定性檢測圖譜（M e3-Em5引物組合）Fig.3 SRAP-PCR p rofiles of 10 DNA sam p les from T.hemsleyanum w ith primer com bination M e3-Em5

表5　篩選出的三葉青SRAP標(biāo)記分析的引物組合Tab.5 Prim er sequence screened for SRAP analysis of T.hemsleyanum

4　討論

SRAP是近年來出現(xiàn)的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，它既克服了RAPD重復(fù)性差的缺點(diǎn)，又克服了RFLP、AFLP成本昂貴、技術(shù)復(fù)雜的缺點(diǎn)，目前廣泛用于物種DNA指紋圖譜構(gòu)建［11］、品種鑒別［12］、親緣關(guān)系分析［13］、遺傳多樣性分析［14］及分子輔助遺傳育種等。但作為一種基于PCR的技術(shù)，結(jié)果受到反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序的影響，為提高其穩(wěn)定性和可靠性，對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化是非常必要的。

擴(kuò)增程序的設(shè)置中退火溫度的確定通常是至關(guān)重要的因素之一，退火溫度過高嚴(yán)重影響擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量及條帶數(shù)，而退火溫度過低則可能增加模板與引物之間非特異性的結(jié)合。本研究采用單因子梯度實(shí)驗(yàn)的方法確定了所篩選出引物的最佳退火溫度。多項(xiàng)研究［15-16］表明，PCR反應(yīng)體系中各因素之間往往存在著交互效應(yīng)，因此，本研究采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)PCR反應(yīng)體系中各影響因素進(jìn)行了篩選。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)［12，15］表明合適用量的Taq酶對(duì)PCR反應(yīng)結(jié)果沒有顯著影響，且本研究對(duì)Taq酶用量做了初步梯度實(shí)驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)其對(duì)PCR結(jié)果有明顯影響，因此，本次正交設(shè)計(jì)中未將其納入影響因素的研究對(duì)象。正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果表明其余四個(gè)因素中DNA模板濃度對(duì)PCR擴(kuò)增影響最大，DNA用量為25 ng時(shí)雖然主帶清晰，但副帶數(shù)量明顯最少，DNA用量在75 ng時(shí)，條帶數(shù)目雖然最多，但是背景模糊，條帶清晰度不高，在適中水平50 ng時(shí)背景干擾低、譜帶多態(tài)性高、主帶清晰、副帶明顯?？赡苁钱?dāng)DNA用量過少時(shí)一些低拷貝的基因片段擴(kuò)增量不足，而DNA用量過高時(shí)，非特異性條帶的擴(kuò)增增強(qiáng)，因此背景模糊，主帶清晰度降低，與王新民在杉木上［15］的研究結(jié)果一致，然而這與懷地黃［11］、山葡萄［12］實(shí)驗(yàn)中得出的模板濃度對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果的影響最不顯著的結(jié)論不同，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)中所采用的模板濃度恰在其擴(kuò)增的閾值范圍，也可能是因?yàn)樗捎玫闹参锘蚪M不同，與引物配對(duì)的區(qū)域和嚴(yán)格程度不同。Mg2+是保證Taq酶活性必需的激活劑，濃度過低會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量降低，過高則會(huì)引起非特異性擴(kuò)增，適宜的濃度一般為0.5～2.5 mmol/L。本實(shí)驗(yàn)中，Mg2+濃度過低時(shí)，出現(xiàn)條帶缺失、亮度減弱等現(xiàn)象，而Mg2+濃度較高時(shí)，雖未出現(xiàn)明顯的非特異性條帶，但背景明顯模糊，擴(kuò)增出的條帶清晰度明顯下降。引物濃度過低會(huì)影響產(chǎn)物形成，但過高容易形成引物二聚體或引起其他非特異性擴(kuò)增，雖然本研究所選較適中的濃度范圍內(nèi)條帶數(shù)量不足以產(chǎn)生明顯變化，但條帶的亮度和清晰度出現(xiàn)了一定程度的變化，引物濃度過低或過高都使條帶較彌散模糊，可能是因?yàn)榻档土四０迮c引物特異性的配對(duì)。

dNTP是PCR反應(yīng)中靶序列擴(kuò)增的原料，濃度過低不足以完成設(shè)定的循環(huán)數(shù)就提前終止反應(yīng)，影響擴(kuò)增結(jié)果，而濃度過高則可能導(dǎo)致PCR錯(cuò)配，從而出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，同時(shí)濃度過高也會(huì)與Taq酶競爭Mg2+，造成酶活性降低，出現(xiàn)無擴(kuò)增產(chǎn)物的現(xiàn)象［12］。本研究雖然dNTP的濃度對(duì)結(jié)果的影響也達(dá)到顯著的水平，但其是四個(gè)因素中最次要的因素，它對(duì)PCR結(jié)果的影響僅在于條帶亮度的區(qū)別，對(duì)條帶的數(shù)量及背景的清晰度沒有顯著影響，與西洋杜鵑［14］的SRAP研究上所得出的結(jié)論一致。

確定了最佳反應(yīng)條件后采用了10份樣品對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證，得到了清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增圖譜，雖然樣品數(shù)量有限，且10份樣品僅來源于浙江和江西兩個(gè)種源地，但該圖譜中所擴(kuò)增出的10條帶中，多態(tài)性條帶仍有4條，多態(tài)性比率達(dá)到40%，因此，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)適合后續(xù)用于三葉青遺傳多樣性分析及遺傳圖譜的構(gòu)建。

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Establishment and optim ization of SRAP reaction system for Tetrastigma hemsleyanum

JIQi-xiong1， PENG Xin1*， WU Xiao-jing2， YANG Xiong-zhi1
（1.Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315100，China；2.Taiji Group Zhejiang East Pharmaceutical Co.，Ltd，Shaoxing 312000，China）

AIM To establish the SRAP reaction system and PCR procedures for Tetrastigma hemsleyanum，collected from Zhejiang and Jiangxi Province，China.METHODS The orthogonal design was applied for optimizing seven factors in the SRAP-PCR reaction system，including Mg2+concentration，dNTP concentration，primer concentration，template DNA dosage，and Taq DNA polymerase dosage.The annealing temperature was chosen on the base of band number and resolution in gradient PCR apparatus.RESULTS The optimal reaction system for ISSR analysis comprised 2.5 mmol/L MgCl2，0.15 mmol/L dNTP，0.15μmol/L primers，50 ng of template DNA，and 1 U of Taq DNA polymerase in 25μL total volume.Proper annealing temperature was 51℃.Eight pairs of primerwhich had rich products and high polymorphism were selected.CONCLUSION SRAP-PCR reaction system for T.hemsleyanum is established and optimized in this study，which is supported using 10 germplasms，these results shows that the SRAP-PCR reaction system is stable and can be used for the genetic analysis of T.hemsleyanum.

Tetrastigma hemsleyanum；SRAP-PCR；orthogonal design

R282.5

A

1001-1528（2015）03-0562-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.03.022

2014-04-02

2013年浙江省公益性技術(shù)資助項(xiàng)目（2013C32103）；2013年浙江省教育廳高?？蒲许?xiàng)目（Y201330174）

紀(jì)其雄（1965—），男，碩士，講師，研究方向?yàn)樗帉W(xué)細(xì)胞工程。E-mail：ji_qixiong@126.com

彭 昕，副教授，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。E-mail：pengx@mail.zjpc.net.cn