楊 輝，常 青，唐成林，唐念珍，田 源，張 毅

骨骼肌損傷是運動中最為常見的軟組織損傷，在肌肉損傷中所占比例最大［26］。在所有肌肉骨骼系統(tǒng)損傷中，鈍器傷是最常見的損傷類型之一［23］。如此高的發(fā)病率讓科研工作者一直致力于有關(guān)骨骼肌損傷修復(fù)機(jī)制的相關(guān)研究，現(xiàn)有研究觀察了藥物、康復(fù)理療等干預(yù)因素對損傷動物模型愈合的促進(jìn)作用。張建、陳世益、李云霞等［12］發(fā)現(xiàn)，在急性骨骼肌鈍挫傷修復(fù)過程中，黃芪皂甙、丹參酮ⅡA注射液能減少損傷區(qū)域纖維疤痕組織形成，對損傷部位骨骼肌纖維直徑無明顯影響。葛新發(fā)、潘衛(wèi)東、董貴俊等［3］發(fā)現(xiàn)，磁納米化的bFGF比直接注射bFGF能明顯改善大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后肌肉收縮應(yīng)力和恢復(fù)應(yīng)力衰減。羅麗、張林、董宇等［9］發(fā)現(xiàn)，低功率激光能增強(qiáng)急性骨骼肌鈍挫傷大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖活性，從而加速骨骼肌的再生，促進(jìn)損傷修復(fù)；Kasemkijwattana、Channarong MD 等［24］通過在損傷骨骼肌中注射生長因子，提高骨骼肌損傷后修復(fù)。但是，有關(guān)運動訓(xùn)練促進(jìn)骨骼肌損傷修復(fù)的文獻(xiàn)卻很少。

N復(fù)合體I，即NADH-泛醌還原酶，是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶，是線粒體中能量產(chǎn)生鏈中的控制標(biāo)志物，在維持細(xì)胞生長、分化和能量代謝以及細(xì)胞保護(hù)方面起著重要作用［1，14，19］。肌衛(wèi)星細(xì)胞是位于肌膜和基底膜之間的梭形單核干細(xì)胞，一般情況下處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到損傷或刺激時即被激活并增殖，然后，與原有骨骼肌細(xì)胞相互融合，形成新的肌纖維細(xì)胞，動物出生后，在肌肉組織的生長和肌肉損傷的修復(fù)過程中起著重要作用［30］。而NO／HGF／c-Met作為肌衛(wèi)星細(xì)胞激活主要信號通路之一［2］，在肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活增殖中發(fā)揮了重要作用。

隨著國家大力發(fā)力發(fā)展競技體育與全民健身運動，運動損傷也大量出現(xiàn)，科學(xué)的防治運動損傷是現(xiàn)今科研工作者面臨的一大難題。本研究結(jié)合現(xiàn)狀，緊接前期研究［5-8］，探討跑臺運動訓(xùn)練與按摩聯(lián)合作用對大鼠骨骼肌急性損傷修復(fù)過程中NADH還原酶及NO／HGF／c-Met通路的影響，研究跑臺運動訓(xùn)練與按摩聯(lián)合作用對炎癥的發(fā)展及肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，為臨床按摩與跑臺運動訓(xùn)練聯(lián)合治療骨骼肌損傷提供一定的實驗理論依據(jù)；也為運動員肌肉損傷的治療方法與康復(fù)手段的發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

本研究共選取12周健康成年雄性SD大鼠76只，體質(zhì)量200～230g／只，均由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（醫(yī)學(xué)動物合格證SCXK渝在20070002）。常規(guī)分籠飼養(yǎng)，每籠1只，室溫（21±2℃），相對濕度為65%～75%，自然光照，每日正常飲水，喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.1.2 主要試劑及儀器

主要試劑:1）NDUFA1Antibody（G-13）試劑，編號 :sc-131623，購自Santa Cruz生物科技公司；2）RNA逆轉(zhuǎn)錄（Perfect Real Time）試劑盒，RNAiso Plus試劑，熒光定量SYBR○RPremix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試 劑 盒，DEPC水，均購自日本TAKARA生物公司。2×Taq MasterMix（含染料）酶 :購自北京天根生化有限公司；3）8%硫化鈉脫毛劑。

主要儀器:小動物跑臺，6跑道，型號:M9W-315587，購自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，低溫離心機(jī)購自德國LEICA生物科技公司，熒光定量PCR儀購自美國ABI生物科技公司 ，PCR儀購自美國MJR生物科技公司。自制軟組織打擊器、AFY—10型按摩器（天津產(chǎn)）。生物顯微鏡、圖像采集系統(tǒng)等設(shè)備由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模

自制打擊器參照了KATSUYA KAMI［25］的模型。在造模的前一天用8%硫化鈉脫毛劑除去B、C、D、E各實驗組大鼠右側(cè)小腿腓腸肌被毛，用10g／L水合氯醛腹腔麻痹后，重物下落導(dǎo)致一次性打擊傷，打擊部位為大鼠右側(cè)小腿內(nèi)側(cè)面（其皮下為腓腸肌中段），打擊器為一打擊面平坦的空心鋁制圓柱體（直徑1cm，長20cm，質(zhì)量20g），底面與木制圓柱體相接（直徑1cm，長2cm，質(zhì)量2g），木制打擊面與打擊部位直接接觸，自制重力錘640g，從25cm高處落下，重力6.27N，產(chǎn)生1.57J的動能打擊力，造成腓腸肌急性中度挫傷模型。造模后即刻麻醉解剖，通過病理、功能檢查，觀察損傷部位肌組織斷裂程度、是否骨折，證實腓腸肌有一定的收縮功能障礙，無骨折，屬急性中度腓腸肌挫傷模型。重力錘的投放和大鼠的固定均由一人操作，保證打擊力和損傷部位及程度的一致性。

1.2.2 分組處理

所有實驗SD大鼠經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成5組。分別為正常對照組（A組，n＝4）、自然恢復(fù)組（B組，n＝24）、按摩組（C組，n＝16）、跑臺組（D組，n＝16）、混合組（E組，n＝16）。各組又根據(jù)造模后時間觀察點不同，B組又分為造模后1d、3d、7d、14d、21d、28d6個亞組（每個亞組4只），C、D、E組分為造模后7d、14d、21d、28d4個亞組（每個亞組4只）。A組為空白對照組，不做任何處理；B、C、D、E組SD大鼠用自制打擊器造大鼠右后肢腓腸肌損傷模型。B組不給予按摩，C組于造模后第3天開始給予按摩，D組于造模后第3天開始給予跑臺運動訓(xùn)練，E組造模后第3天開始給予按摩加跑臺運動訓(xùn)練。正常對照組于造模前一天取標(biāo)本；自然恢復(fù)組1d、3d、7d、14d、21d、28d處死大鼠取標(biāo)本；C、D、E組分別造模后7d、14 d、21d、28d處死大鼠取標(biāo)本。提取大鼠右側(cè)腓腸肌損傷最嚴(yán)重區(qū)域的肌肉，一部分用PBS緩沖液沖洗干凈后，放入事前標(biāo)記好的1.5ml離心管，于液氮凍存0.5h，然后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱，待Western Blot檢測肌組織NADH還原酶蛋白量，待實時熒光PCR檢測nNOS、HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平；另一部分用生理鹽水清洗干凈后，用4%多聚甲醛固定，備以石蠟切片及HE染色。

1.3 跑臺運動訓(xùn)練干預(yù)方案

造模后第3天，跑臺組、混合組實驗大鼠介入跑臺運動訓(xùn)練。在動物的暗周期進(jìn)行訓(xùn)練，每周訓(xùn)練5d，每天訓(xùn)練1次。跑臺運動恢復(fù)訓(xùn)練參照Bedford［16］訓(xùn)練方案進(jìn)行（表1）。

1.4 按摩干預(yù)方案

造模后第3天，按摩組、混合組實驗大鼠介入震動按摩治療。實驗大鼠震動按摩干預(yù)操作步驟:1）實驗大鼠按1ml／kg體質(zhì)量用10g／L水合氯醛進(jìn)行腹腔麻痹；2）麻醉后將實驗大鼠以側(cè)臥位的方式固定，損傷側(cè)位于健側(cè)腿之上；3）將天津產(chǎn)AFY-10型小動物按摩器按摩頭固定于大鼠受損腓腸肌中部及鄰近肌組織下；4）讓按摩頭對受損組織進(jìn)行按摩干預(yù)，設(shè)置按摩頭轉(zhuǎn)速為2600r／min，按摩時間為15min，每天1次［10］。

表1 本研究大鼠跑臺運動訓(xùn)練方案一覽表Table 1 Proposal of Treadmill Running Exercise

1.5 實時熒光定量PT-PCR檢測大鼠骨骼肌nNOS、HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平

1.5.1 引物設(shè)計與合成

檢索美國國立生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫（Gene Bank）中nNOS、HGF mRNA序列，用Primer P remier5.0軟件設(shè)計出nNOS、HGF基因以及內(nèi)參GAPDH基因的上下游引物序列（表2），均由TAKARA生物工程（大連）有限公司合成。

表2 nNOS、HGF和GAPDH基因引物序列一覽表Table 2 Sequences and Detalls of Target Genes

1.5.2 總RNA提取與鑒別

選取凍存于-80℃冰箱中離心管的樣本，加入液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，按照RNAiso Plus試劑盒說明書提取RNA。用TE Buffer稀釋RNA后測定吸光度，使用紫外分光光度計檢測，OD260／OD280比值在1.7～2.1為好。

1.5.3 RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

取1μg的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TAKARA）配配制PT反應(yīng)液（總體積10μl），逆轉(zhuǎn)錄后得cDNA模板。

1.5.4 實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）

Realtime PCR反應(yīng)體系為20μl，其中，SYBR○RGreen PCR Master Mix（TOYOBO）10μl，前向、反向引物各1μl，dH206μl，cDNA 模 板 2μl。 反 應(yīng) 條 件，tep 1:預(yù) 變 性（95℃，30s）；Step 2:（95℃，15s；55℃／56℃，30s；65℃，30s）×40個循環(huán)；Step3:擴(kuò)增建立PCR產(chǎn)物的熔解曲線，再變性 （95℃，15s），退 火 （55℃／56℃，35s），然 后，從55℃／56℃緩慢加熱到（95℃，15s）；每1℃收集熒光一次。經(jīng)儀器自動分析，各基因融解曲線（Melt Curve）均為單峰，表明擴(kuò)增產(chǎn)物特異性較高。反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀給出各反應(yīng)孔的Ct值，以GAPDH基因為內(nèi)參，根據(jù)公式2-△Ct（△CT＝CT-target-CTGAPDH）計算出樣品目的基因的相對表達(dá)量。

1.6 Western Blot檢測肌組織NADH還原酶蛋白量

1）灌制聚丙烯凌膠，10%分離膠，4%濃縮膠；2）上樣量50μg，每樣至少上2塊平行膠；3）電泳電壓濃縮膠90 V，分離膠160V，電泳液為甘氨酸緩沖液；4）電泳結(jié)束后，取出凝膠，和相同大小的PVDF（先用95%乙醇固定）置于3層濾紙中間，放入轉(zhuǎn)移槽中，加滿轉(zhuǎn)移液，300mA約90 min；5）取出PVDF膜，自然晾干后，置于95%乙醇中固定；自然晾干；6）0.01MPBST洗5min；7）放入5%脫脂奶粉中封閉非特異性蛋白，37℃恒溫?fù)u床下約4h；8）加I抗體（1∶1000用0.01MPBT配制），37℃恒溫?fù)u床下3～4h；9）0.01MPBST洗15min×3次；10）加 HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000用0.01MPBST配制），室溫下1～2h；11）0.01M PBST洗15min×3次；12）將PVDF置于NEN化學(xué)發(fā)光試劑中增強(qiáng)反應(yīng)1～3min；13）在暗室中使X光片爆光，常規(guī)方法顯影，定影，并掃入凝膠成象系統(tǒng)進(jìn)行圖象分析，計算光密度值（OD值），重復(fù)3次。

1.7 組織學(xué)觀察

取出固定于4%多聚甲醛的各實驗大鼠受損腓腸肌標(biāo)本，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、然后切片5μm／片，HE染色后置于生物顯微鏡下觀察受損組織病理學(xué)改變，在圖像采集系統(tǒng)下獲取圖片。

1.8 數(shù)據(jù)處理

圖2 本研究自然對照組大鼠小腿腓腸肌組織學(xué)觀察圖（HE，400×）Figure 2.The Histological Observation of the Gastrocnemius in Control Group（HE，400×）

2 實驗結(jié)果

2.1 造模前、后實驗各組大鼠骨骼肌組織變化

正常對照組大鼠骨骼肌肌節(jié)結(jié)構(gòu)完整，肌絲排列整齊，肌細(xì)胞正常（圖1A）。自然恢復(fù)組大鼠肌纖維斷裂、碎解，炎癥細(xì)胞浸潤，吞噬碎片，肌節(jié)結(jié)構(gòu)紊亂（圖1B）。

圖1 本研究大鼠小腿腓腸肌組織學(xué)觀察圖（HE，400×）Figure 1.The Histological Observation of the Gastrocnemius in Rats（HE，400×）

自然恢復(fù)組7天后可見少量成肌細(xì)胞，炎癥細(xì)胞減少，線粒體較少；14天后出現(xiàn)肌管自然恢復(fù)組出現(xiàn)在肌管，成肌細(xì)胞核出現(xiàn)，周圍有新生肌纖維；21天后肌管融合，損傷部位出現(xiàn)疤痕組織；28天后，損傷部位基本愈合，但是疤痕組織明顯（圖2）。

按摩組7天后炎癥細(xì)胞減少明顯，出現(xiàn)少量線粒體、大量成肌細(xì)胞，并有一定量成肌細(xì)胞核出現(xiàn)，周圍有大量新生肌纖維，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖明顯；14天后大量肌管出現(xiàn)，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖更加明顯，肌纖維排列有序；21天后肌管融合，肌纖維排位整齊，損傷部位基本愈合:28天后損傷部位完全愈合，疤痕組織微?。▓D3）。

跑臺組7天后炎癥細(xì)胞減少亦明顯，出現(xiàn)大量線粒體，大量成肌細(xì)胞:14天后出現(xiàn)大量肌管，并融合成肌纖維，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖明顯；21天后，肌纖維排列整齊，損傷部位基本愈合；28天后損傷部位完全愈合，肌組織排列整齊，少量疤痕組織，與正常對照組無異（圖4）。

混合組7天后炎癥細(xì)胞基本消失，出現(xiàn)大量線粒體，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖明顯，出現(xiàn)大量肌纖維；14天后，肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖更加明顯，新生肌纖維相互融合，排列整齊；21天后，損傷肌組織已基本痊愈，新生肌纖維排列整齊，并伴有大量成肌細(xì)胞核:28天后，損傷部位痊愈，基本無疤痕組織，與正常對照組肌組織相比，混合組有更多成肌細(xì)胞 核、線粒體，肌組織排列更加緊湊（圖5）。

圖3 本研究按摩組大鼠小腿腓腸肌組織學(xué)觀察圖（HE，400×）Figure 3.The Histological Observation of the Gastrocnemius in Massage Group（HE，400×）

圖4 本研究跑臺組大鼠小腿腓腸肌組織學(xué)觀察圖（HE，400×）Figure 4.The Histological Observation of the Gastrocnemius in Treadmill Exercise Group（HE，400×）

圖5 本研究混合組大鼠小腿腓腸肌組織學(xué)觀察圖（HE，400×）Figure 5.The Histological Observation of the Gastrocnemius in Mixed Group（HE，400×）

圖6 本研究各組大鼠骨骼肌中NADH還原酶蛋白量比較圖Figure 6.NADH Reductase Protein in Each Group

2.2 Western Blot檢測實驗各組肌組織NADH還原酶蛋白量結(jié)果

表3顯示，C、D、E組與B組比較，肌組織NADH還原酶蛋白量明顯增高，且具有極顯著性差異（P＝0＜0.01），說明干預(yù)組比自然恢復(fù)組能量代謝更好；E組與C、D組比較，肌組織NADH還原酶蛋白量明顯增高，且具有極顯著差異（P＝0＜0.01），混合組增加肌細(xì)胞NADH還原酶蛋白量效果最明顯；D組與C組比較，肌組織NADH還原酶蛋白量明顯增高，且具有極顯著差異（P＝0.006＜0.01），在提高肌組織NADH還原酶蛋白量上，跑臺組比按摩組明顯。

表3 本研究各組大鼠骨骼肌中NADH還原酶蛋白量的比較一覽表Table 3 NADH Reductase Protein in Each Group

2.3 實驗各組骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA整體轉(zhuǎn)錄水平實時熒光定量PCR檢測結(jié)果

表4顯示，C、D、E組與B組比較，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA整體轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，且具有極顯著差異（P＝0＜0.01）；E組與C、D組比較，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA整體轉(zhuǎn)錄水平明顯增高，且具有極顯著差異（P＝0＜0.01）。

表4 本研究大鼠骨骼肌中nNOS、HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平一覽表Table 4 nNOS，HGF mRNA Transcription in Each Group

2.4 實驗各組骨骼肌NADH還原酶，nNOS、HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平治療前后對比

通過跑臺運動訓(xùn)練與按摩的聯(lián)合作用，控制組各組骨骼肌損傷區(qū)域NADH還原酶，nNOS、HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于自然恢復(fù)組，這說明跑臺運動訓(xùn)練與按摩能明顯改善骨骼肌損傷的修復(fù)，在修復(fù)效果上，聯(lián)合干預(yù)好于單獨干預(yù)，跑臺運動訓(xùn)練效果好于按摩。

圖6 本研究各實驗大鼠治療前、后骨骼肌中NADH還原酶、nNOS、HGF mRNA轉(zhuǎn)錄水平圖Figure 6.Comparison of NADH Reductase、nNOS，HGF mRNA Transcription of the Control and the Model

3 討論

骨骼肌損傷修復(fù)過程的極其復(fù)雜性，使骨骼肌損傷一直成為現(xiàn)在研究的熱點和難點。骨骼肌急性損傷后，肌纖維膜受損，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋外溢，導(dǎo)致局部Ca2＋濃度升高，激活Ca2＋依賴的蛋白酶，抑制正常線粒體呼吸，激活補(bǔ)體，募集炎癥細(xì)胞，引起局部壞死。隨后，炎癥因子會釋放一些成肌細(xì)胞趨化因子和促分裂因子［20，28］，緊接著血管化隨著吞噬作用而發(fā)現(xiàn)，并釋放一些血管源性因子，如IGF、FGF等［28］。肌成肌細(xì)胞趨化因子和促分裂因子激活肌衛(wèi)星細(xì)胞與纖維母細(xì)胞參與修復(fù)，它們增殖、增生、分化、融合，形成新肌管，在這個過程中，新生的肌纖維通常從未受傷部分開始，向受損區(qū)域延伸，數(shù)個新形成的肌管向幸存的肌纖維融合［22，29］。如果成纖維細(xì)胞過程增殖則會形成疤痕組織，導(dǎo)致不完全的恢復(fù)，影響肢體正常功能。

在這個復(fù)雜的動態(tài)修復(fù)過程中，炎癥的發(fā)展以及肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活增殖對骨骼肌損傷的修復(fù)都具有十分重要的作用。炎癥反應(yīng)學(xué)說提出鈣離子在骨骼肌損傷中起觸發(fā)作用，當(dāng)肌組織受到損傷，肌膜上K＋-Na＋-ATPase異常，影響肌細(xì)胞K＋-Na＋交換、Ca2＋超載，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)受損，三羧酸循環(huán)發(fā)生困難，氧化磷酸化過程中的能量轉(zhuǎn)換異常，活性氧類物質(zhì)逐漸累積，進(jìn)一步造成肌膜、線粒體膜的破壞，導(dǎo)致能量代謝障礙以至細(xì)胞死亡［4，31］。能量的代謝對于骨骼肌損傷后炎癥的發(fā)展起著決定性的作用。NADH還原酶簡稱復(fù)合體Ⅰ（complexⅠ），作為線粒體呼吸鏈上的重要限速酶，在生物氧化過程中起著電子傳遞的作用，是細(xì)胞能量代謝所必需的輔酶。NADH還原酶的活性和蛋白量直接影響細(xì)胞能量的代謝，它通過影響肌膜K＋-Na＋-ATPase的活性來影響 K＋-Na＋交換、Ca2＋代謝。當(dāng)損傷肌組織炎癥持續(xù)發(fā)展，NADH還原酶活性被抑制，直接導(dǎo)致肌膜K＋-Na＋-ATPase的活性下降，K＋-Na＋交換、Ca2＋代謝障礙，Ca2＋超載，更多的線粒體結(jié)構(gòu)、肌漿網(wǎng)受損，進(jìn)而引起局部組織結(jié)構(gòu)損傷的加重和肌肉內(nèi)部的損傷，出現(xiàn)肌原纖維斷裂，線粒體膜、肌膜的破壞等現(xiàn)象，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死。而受損、壞死的細(xì)胞吸引炎癥細(xì)胞聚集，分泌更多的炎癥因子，抑制了肌成肌細(xì)胞趨化因子和促分裂因子分泌，影響了肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增生、分化、融合形成肌管的再生修復(fù)過程?？梢姡琋ADH還原酶的活性與骨骼肌損傷的修復(fù)也密切相關(guān)。

一般情況下，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激時，如損傷、牽拉或肌肉萎縮引起的病變時，衛(wèi)星細(xì)胞能夠被激活［17］。Angelis［18］在有關(guān)損傷區(qū)域肌衛(wèi)星細(xì)胞作用的研究中認(rèn)為，肌肉損傷區(qū)肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化，是達(dá)到損傷修復(fù)目的的主要途徑。有研究表明，NO／HGF／c-Met信號通路對肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活起著關(guān)鍵作用。骨骼肌細(xì)胞在受到刺激后可通過相應(yīng)機(jī)制增加一氧化氮合酶數(shù)量或活性，然后，合成并釋放NO，成為肌衛(wèi)星細(xì)胞激活的起始信號；NO介導(dǎo)HGF及c-MET在肌衛(wèi)星細(xì)胞的共同定位作用［32］；HGF一方面與其受體c-MET結(jié)合，引發(fā)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和絲裂原活化蛋白激酶等相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞分裂的多個信號通路；另一方面，下調(diào)肌肉生長抑制素水平以保持肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息狀態(tài)，從而激活肌衛(wèi)星細(xì)胞［28］。肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、增生、分化、融合，最終形成新肌管，完成修復(fù)。nNOS、HGF mRNA表達(dá)的量決定了NOS、HGF蛋白的量，NOS介導(dǎo)NO的合成，間接影響NO介導(dǎo)的NO／HGF／c-Met信號通路，影響肌衛(wèi)星細(xì)胞的激活、增生、分化以及融合形成肌管。

前期研究已發(fā)現(xiàn)，骨骼肌損傷修復(fù)的生理生化機(jī)制。按摩可以增強(qiáng)SDH和K＋-Na＋-ATPase酶活性的。按摩可以抑制兔鈍挫傷骨骼肌瘢痕的形成，兔骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中堿性成纖維細(xì)胞生長因子有干預(yù)作用以及有促進(jìn)骨骼肌損傷后肌纖維再生［11］等。查閱國內(nèi)、外最新研究報道，卻沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)跑臺運動訓(xùn)練與按摩聯(lián)合作用對骨骼肌急性損傷修復(fù)過程中線粒體呼吸鏈關(guān)鍵酶NADH還原酶及肌衛(wèi)星細(xì)胞NO／HGF／c-Met通路的研究。本研究采用跑臺運動訓(xùn)練結(jié)合按摩聯(lián)合干預(yù)的方法，探討聯(lián)合療法對骨骼肌急性損傷修復(fù)的影響。

臨床上將骨骼肌損傷程度分為 3度［15，23］:輕度（1°）:少量肌纖維損傷并伴有輕微腫脹，沒有或僅有輕微的力量和活動受限；中度（2°）:絕大部分肌纖維損傷，肌力明顯下降:重度（3°）:損傷范圍涉及整塊肌肉橫截面，波及臨近肌肉組織，損傷后肌肉功能完全喪失。損傷程度直接影響炎癥反應(yīng)、肌纖維再生和肌纖維化程度［13］。輕度損傷一般可以自動痊愈，中度和重度損傷伴隨著肌纖維和脈管系統(tǒng)的破裂，最終出現(xiàn)瘢痕修復(fù)。本研究以大鼠骨骼肌急性中度損傷模型為研究對象，突出動物自身的運動修復(fù)，在修復(fù)中恢復(fù)損傷部位的正常功能，主要包括肌力和關(guān)節(jié)度的恢復(fù)。本研究運用HE染色，Western Blot檢測肌組織NADH還原酶蛋白量，實時熒光PCR檢測肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA表達(dá)量，研究了跑臺運動訓(xùn)練與按摩聯(lián)合干預(yù)對骨骼肌急性損傷修復(fù)過程N(yùn)ADH還原酶，及肌衛(wèi)星細(xì)胞NO／HGF／c-Met通路的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過4周的跑臺運動訓(xùn)練和按摩介入治療，按摩組C組、跑臺組D組、混合組E組，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA表達(dá)量，肌組織NADH還原酶蛋白量均比自然恢復(fù)組B組高，且具有極顯著性差異（P＜0.01）；混合組與按摩組、跑臺組比較，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA表達(dá)量、肌組織NADH還原酶蛋白量更高，且具有極顯著差異（P＜0.01）；跑臺組與按摩組比較，骨骼肌肌衛(wèi)星細(xì)胞中nNOS、HGF mRNA表達(dá)量更高，且具有極顯著差異（P＜0.01），肌組織NADH還原酶蛋白量也比按摩組高，且具有顯著差異（P＜0.05）。這說明，聯(lián)合治療更能有效地提高肌組織中nNOS、HGF mRNA表達(dá)量、肌組織NADH還原酶，通過提高肌組織NADH還原酶的量，增強(qiáng)線粒體的呼吸作用，產(chǎn)生更多的ATP，改善肌膜K＋-Na＋-ATPase的活性，調(diào)節(jié)NA＋-K＋的交換，Ca2＋的轉(zhuǎn)運，減輕Ca2＋超載，減少活性氧類物質(zhì)累積，減輕線粒體結(jié)構(gòu)的破壞以及線粒體膜、肌膜的損傷，減少炎癥細(xì)胞的聚集，減少炎癥因子的分泌，增加成肌細(xì)胞趨化因子和促分裂因子的分泌，從而阻止了炎癥的發(fā)展、減少了細(xì)胞的損傷、死亡，促進(jìn)了肌前體細(xì)胞的激活、增生、分化的再生修復(fù)過程；另一方面，聯(lián)合治療可以明顯提高nNOS、HGF mRNA表達(dá)量，提高了肌組織內(nèi)NOS的產(chǎn)生，促進(jìn)肌細(xì)胞產(chǎn)生更多的NO，通過NO介導(dǎo)的NO／HGF／c-Met信號通路，激活更多肌衛(wèi)星細(xì)胞，進(jìn)而有更多的肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖、增生、分化、融合成肌管，形成更多肌纖維，增加修復(fù)的速度。聯(lián)合干預(yù)比單一手段干預(yù)能更好地阻止炎癥的發(fā)展及促進(jìn)后期骨骼肌損傷的修復(fù)速度，在骨骼肌損傷修復(fù)的整個過程中都發(fā)揮著重要作用。跑臺運動訓(xùn)練與按摩相比，前者在阻止炎癥的發(fā)展及促進(jìn)后期骨骼肌損傷的修復(fù)速度的效果上好于后者。總之，聯(lián)合治療能有效阻止骨骼肌急性損傷后早期炎癥的發(fā)展，促進(jìn)和提高骨骼肌損傷后肌衛(wèi)星細(xì)胞的再生修復(fù)過程。

4 結(jié)論

在骨骼肌急性損傷修復(fù)過程中，跑臺運動訓(xùn)練與按摩聯(lián)合作用比單獨的跑臺運動訓(xùn)練或按摩干預(yù)能更有效地提高骨骼肌中NADH還原酶蛋白量及NOS、HGF mRNA表達(dá)量，能提高機(jī)體能量代謝水平，有效阻止骨骼肌急性損傷后早期炎癥的發(fā)展，促進(jìn)和提高骨骼肌損傷后肌衛(wèi)星細(xì)胞的再生修復(fù)過程，在骨骼肌損傷修復(fù)的整個過程中發(fā)揮著重要作用。

本研究進(jìn)一步完善了按摩對骨骼肌損傷修復(fù)過程中細(xì)胞內(nèi)修復(fù)相關(guān)因子的作用機(jī)制的證據(jù)鏈，為臨床上進(jìn)行跑臺運動訓(xùn)練與按摩聯(lián)合干預(yù)治療骨骼肌急性損傷提供了一定的依據(jù)。

5 研究展望

最新的研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌損傷中，超早期介入按摩比晚期介入按摩更有利于恢復(fù)肌肉功能和調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞浸潤［21］。在未來的研究中，本研究團(tuán)隊將圍繞超早期介入按摩對骨骼肌急性損傷修復(fù)過程中細(xì)胞膜修復(fù)的影響機(jī)制展開研究，進(jìn)一步完善按摩對于骨骼肌損傷修復(fù)的作用機(jī)制。

［1］查錫良，周春燕.生物化學(xué)（第7版）［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:160-178.

［2］馮振偉，江黎明，陳孝文，等.IL-13對大鼠急性腎缺血再灌注時IL-1β表達(dá)的影響［J］.中國病理生理學(xué)雜志，2003，19（3）:930-934.

［3］葛新發(fā)，潘衛(wèi)東，董貴俊，等.利用堿性成纖維細(xì)胞生長因子包裹的磁性納米粒對大鼠急性骨骼肌鈍挫傷后肌肉收縮力與松弛特性恢復(fù)的影響研究［J］.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2010，29（5）:538-541.

［4］鄺勇，黃躍生.微管損傷與缺氧心肌細(xì)胞線粒體損害的關(guān)系研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2006，28（15）:1547-1549.

［5］侯懿烜，柳滿然，張萍，等.骨骼肌損傷修復(fù)的生理生化機(jī)制研究［J］.激光生理學(xué)報，2011，20（5）:662-667.

［6］侯懿烜，鄭元義，張萍，等.按摩增強(qiáng)SDH和鉀鈉-ATPase酶活性促進(jìn)兔股四頭肌的損傷修復(fù)［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報.2011，33（19）:2012-1015.

［7］劉仁建，唐成林.兔骨骼肌鈍挫傷恢復(fù)過程中堿性成纖維細(xì)胞生長因子的變化及按摩的干預(yù)作用［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013，38（11）:1303-1307.

［8］劉仁建，唐成林，鄒敏，等.按摩抑制兔鈍挫傷骨骼肌瘢痕形成的機(jī)制研究［J］.中華物理與康復(fù)雜志，2012，34（10）:742-746.

［9］羅麗，張林，董宇.低功率激光對急性骨骼肌鈍挫傷大鼠肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖活性的影響［J］.體育科學(xué)，2007，27（7）:55-58.

［10］石葛明，王學(xué)理，李佳桐，等.按摩對肌肉損傷修復(fù)作用的形態(tài)學(xué)研究［J］.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，1991，10（4）:201-204.

［11］謝輝，唐成林，陳曉玲，等.按摩促進(jìn)骨骼肌損傷后肌纖維再生機(jī)理的研究［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013:190-194.

［12］張建，陳世益，李云霞，等.黃芪皂甙、丹參酮ⅡA注射液對大鼠骨骼肌急性鈍挫傷后骨骼肌組織形態(tài)的影響［J］.中國運動醫(yī)學(xué)雜志，2011，30（3）:270-274.

［13］AMERCIAN ACADEMY OF ORTHOPAEDIC SUIGEONS.The Burden of Musculoskeletal Disease in the United States［EB／OL］.Http:／／www.bineandjointburden.org，2012-01-20.

［14］BAKER M A，LAW EN A.Plasma membrane NADH oxidoreductase system:a critical review of the structural and functional data［J］.Anti Red Sign，2000，2（2）:197-212.

［15］BLANKENBAKER D G，TUITE M J.Temporal changes of muscle injury［J］.Semin Musculoskelet Radiol，2010:14（2）:176-193.

［16］BEDFORD T G，TIPTON C M，WILSON N C，et al.Maximum oxygen consumption of rats and its changes with various experimental procedures［J］.J Phys:Respirat，Environ Exe Phys，1980，47（6）:1278-1283.

［17］CHARGE S B，RUDNICKI M A.Cellular and molecular regulation of muscle regeneration［J］.Phys Rev，2004，（84）:209-238.

［18］DE ANGELIS L，BERGHELLA L，COLETTA M，et al.Skeletal myogenic progenitors originating from embryonic dorsal aorta coexpress endothelial and myogenic markers and contribute to postnatal muscle growth and regeneration［J］.J Cell Biology，1999，174（4）:695-698

［19］FERNANDES M A，GERALDES C F，OLIVEIRA C R，et al.Effects of NADH and H2O2on chromate induced human erythrocytes hemoglobin oxidation and peroxidation［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2000，47（1）:39-42.

［20］GROUNDS M D.Towards understanding skeletal muscle re-generation［J］.Path Res Pract，1991，（187）:1-22.

［21］HAAS C，BUTTERFIELD T A，ABSHIRE S，et al.Massage timing affects postexercise muscle recovery and inflammation in a rabbit model［J］.Med Sci Sports Exe，2013，45（6）:1105-1112.

［22］HURME T，KALIMO H.Activation of myogenic precuisor cells after muscle injury［J］.Med Sci Sports Exe，1992，24:197-205.

［23］JARVINEN T A，JARVINEN T L，KAARIAINEN M.Muscle injures:biology and treatment［J］.Am J Sports Med，2005，33（5）:745-764.

［24］KASEMKIJWATTANA C，MENETREY J，BOSCH P，et al.Use of growth factors to improve muscle healing after strain injury［J］.Clin Orthop Relat Res，2000，（370）:272-285.

［25］KATSUYA KAMI，MITSUHIKO MASUHARA，HITOSHI KASAHIBA，et al.Changes of vinculin and extracelluar matrix components following blunt treuma to rat skeletal muscle［J］.Med Sci Sports Exe，1993，25，（7）:832-840.

［26］LOCKHART N C，BROOKS S V.Protection fnom contraction-induced injury provided to skeletal muscles of young and old mice by passive stretch is not due to a decrease in initial mechanical damage［J］.J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2006，61（6）:527-533.

［27］MCCROSKERY S，TJOMAS M，PLAAT L，et al.Improved muscle healing through enhanced regeneration and reduced fibrosis in myostatin-null mice［J］.J Cell Sci，2005，118（Pt 15）:3531-3541.

［28］RABERTSON T A，MALEY M A，GROUNDS M D，et al.The role of macrophages in skeletal muscle regeneration with particular reference to chemotaxis［J］.Exp Cell Res，1993，（207）:321-331.

［29］ROBERTSON T A，PAPADIMITRION J M，GROUNDS M D，et al.Fusion of myogenic cells to the newly sealed region of damaged myofibres in skeletal muscle regeneration［J］.Neuropathol Appl Neurobiol，1993，（19）:350-358.

［30］SHEFER G，VAN DE MARK D P，RICHARDSON J B，et al.Satellitecell pool size does matter:defining the myogenic potency of aging skeletal muscle［J］.Dev Biol，2006，294（1）:50-66.

［31］SHU B，SHEN Y，WANG A M，et al.Histological，enzymohistochemical and biomechanical observation of skeletal muscle injury in rabbits［J］.Chin J Traumatol，2007，10（3）:150-153.

［32］TATSUMI R，WUOLLET A L，TABATA K，et al.A role for calcium-calmodulin in regulating nitricoxide production during skeletal muscle satellite cell activation［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2009，296（4）:C922-C929.