程啟明， 黃 青， 廖禎妮， 楊建文， 吳道聰， 蘇 麗

(1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西南寧 530004； 2.中國科學(xué)院城市環(huán)境研究所，城市環(huán)境與健康重點(diǎn)實(shí)驗室，福建廈門 361021； 3.紅河千山生物工程有限公司，云南瀘西 652400)

燈盞花(Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand-Mazz)是治療心腦血管疾病中普遍使用的中草藥[1]，因其需求量大，故近年被大量馴化栽培。由于燈盞花生長周期長，田間雜草瘋長對燈盞花產(chǎn)量造成了嚴(yán)重影響，故一些除草劑被用以提高產(chǎn)量，其中三嗪類和二硝基苯胺類除草劑[2，3]因效果顯著而被大量施用。目前國內(nèi)關(guān)于中草藥中農(nóng)藥殘留限量的規(guī)定還比較少[4]，《中國藥典》(2010版)中也僅在甘草、黃芪等少量藥材中明確了六六六、滴滴涕等少量農(nóng)殘的限量要求，但歐盟、日本等發(fā)達(dá)國家對進(jìn)口中藥材制定了嚴(yán)格的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(MRL)。目前，國內(nèi)相關(guān)農(nóng)殘的報道多集中于蔬菜和水果、食品、牛奶、大豆等[5 - 8]，而燈盞花中除草劑殘留未見相關(guān)研究報道。

農(nóng)藥殘留分析方法通常采用氣相色譜、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等方法[7,9 - 11]。樣品前處理常采用超聲法、均質(zhì)法和振蕩法等[12]，但這些方法存在有機(jī)溶劑用量大、耗時長以及農(nóng)殘?zhí)崛〔煌耆那闆r。加速溶劑萃取(ASE)是一種新型的樣品提取方法[13]，具有提取效率高、時間短及所用溶劑少等特點(diǎn)，已被美國環(huán)保署(EPA)規(guī)定為處理固體樣品的標(biāo)準(zhǔn)方法之一，但在植物與土壤中的應(yīng)用研究報道不多見。本研究旨在探討不同基質(zhì)樣品，以長殘效除草劑阿特拉津和易降解除草劑二甲戊樂靈為對象，建立燈盞花中除草劑的殘留分析方法。

1 實(shí)驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Agilent 7890N/5975C氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，安捷倫公司)；ASE-350加速溶劑萃取儀(Dionex中國有限公司)；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)(Milli-Pore公司)；KQ-5200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山蘇美自動化科技有限公司)；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司)；Laborata-4000-Efficient旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國，Heidolph公司)；LG-500A高速中藥粉碎機(jī)(瑞安市百信藥機(jī)器械廠)。

阿特拉津(Atrazine)標(biāo)準(zhǔn)品(100±0.12 mg/L)和二甲戊樂靈(Pendimethalin)標(biāo)準(zhǔn)品(100±0.13 mg/L)(農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研檢測所)，于4 ℃冰箱貯存。根據(jù)需要將兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用空白基質(zhì)溶液稀釋配制成基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取100 mg/L 2種標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解定容，配制成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

乙腈、丙酮、二氯甲烷、正己烷(色譜純，美國TEDIA公司)；氧化鋁(100～200目)、硅藻土、無水硫酸鈉、弗羅里硅土(60～100目)(使用前在馬弗爐內(nèi)450 ℃烘4 h，200 ℃時取出置干燥器中冷卻備用)、活性炭(分析純，國藥集團(tuán))(使用前在烘箱中105 ℃烘烤過夜，取出置干燥器中冷卻備用)。

1.2 樣品采集

1.2.1樣品采集燈盞花及其土壤樣品采自云南某燈盞花種植基地。燈盞花(干樣)樣品采集全草，其土壤距地表0～15 cm，每個地塊采集3個平行樣本。

1.2.2樣品提取將燈盞花植株和風(fēng)干土粉碎后過20目篩。稱取燈盞花或土壤樣品2.000 g(0.001 g)、無水硫酸鈉10 g、活性炭1 g，混勻后裝入11 mL萃取池中(上下層分別填裝硅藻土，中間為樣品)，使用丙酮-二氯甲烷(1∶1，V/V)混合溶劑，溫度60 ℃，壓力10.3 MPa，預(yù)熱5 min，靜態(tài)萃取10 min，循環(huán)2次，清洗萃取池體積60%，吹掃時間120 s，用丙酮-二氯甲烷(1∶1)混合溶劑快速沖洗樣品，將提取液轉(zhuǎn)移至250 mL燒瓶中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，40 ℃水溫60 r/min轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1 mL左右，轉(zhuǎn)移至層析柱凈化。

1.2.3樣品凈化砂芯玻璃層析柱(25×1.0 cm)自上而下依次裝填3 cm無水硫酸鈉、7 cm弗羅里硅土、3 cm無水硫酸鈉，預(yù)先用30 mL正己烷預(yù)淋洗柱子，等淋洗液到達(dá)上層無水硫酸鈉上界面時，關(guān)閉層析柱底部開關(guān)，棄去淋洗液。將待凈化的提取液轉(zhuǎn)入層析柱，用50 mL正己烷∶丙酮(9∶1，V/V)進(jìn)行洗脫，收集淋出液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)至干，用正己烷溶解至10 mL具塞試管中，用氮吹儀濃縮至1～2 mL，加入少量正己烷，繼續(xù)氮吹濃縮至少量，重復(fù)二次，用正己烷定容至1 mL于色譜條件下進(jìn)行分析。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣：氦氣，純度大于99.999%；恒流模式，流速：1.0 mL/min；程序升溫：80 ℃保持1 min，以40 ℃/min升至200 ℃，然后以20 ℃/min升至280 ℃，保持3 min，分析時長11 min，以290 ℃后運(yùn)行1 min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件:離子源溫度：230 ℃，接口溫度：280 ℃，電離方式：電子轟擊電離(EI)，電離能量70 eV，掃描方式：選擇離子掃描(SIM)。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取與凈化方式的選擇

2.1.1提取方式的優(yōu)化研究中對比了二氯甲烷(DCM)、乙腈以及兩種混合溶劑正己烷-丙酮(1∶1,V/V)、二氯甲烷-丙酮(1∶1,V/V)。結(jié)果表明，乙腈與二氯甲烷-丙酮(1∶1,V/V)提取效率相當(dāng)，考慮到乙腈毒性相對較大以及便于后續(xù)凈化處理，選用二氯甲烷-丙酮作為提取溶劑。采用ASE法提取時發(fā)現(xiàn)溫度高于60 ℃、時間超過10 min，部分農(nóng)藥會發(fā)生分解，導(dǎo)致回收率降低；按1.2.2項對加標(biāo)樣品提取后的殘渣再次提取并檢測，未檢出除草劑，表明ASE能有效提取燈盞花及其土壤中的2種除草劑。

2.1.2凈化方式的優(yōu)化基于燈盞花全草成分含有大量的有機(jī)酸、酚類、苷類和色素等成分，使得基體具有顏色，故對比了弗羅里硅土(60～100目)和中性氧化鋁(100～200目)吸附劑在柱層析的凈化差異。結(jié)果表明，弗羅里硅土洗脫各種農(nóng)藥殘留相對容易，并能有效地吸附燈盞花中的各種色素等雜質(zhì)，故將弗羅里硅土作為填充柱凈化材料之一。此外，2種除草劑用50 mL正己烷/丙酮(9∶1,V/V)能有效洗脫，減少洗脫液則洗脫不完全，加大洗脫液用量回收率雖有微弱上升，但色譜圖雜質(zhì)峰顯著增多，基質(zhì)效應(yīng)增加。

2.2 線性關(guān)系及檢出限

分別取一定體積各農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲備液混合，用正己烷逐級稀釋至系列質(zhì)量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。為避免基質(zhì)效應(yīng)對定量的影響，通過向空白基質(zhì)中定量添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的方式，分別配制了燈盞花和土壤的各系列濃度基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。在選定儀器條件下測定。以質(zhì)譜定量離子色譜峰面積(Y)對濃度(X,mg/L)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表1。2種除草劑的燈盞花及土壤基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的GC-MS圖見圖1。結(jié)果表明：阿特拉津、二甲戊樂靈2種農(nóng)藥在0.05～2.0 mg/L范圍內(nèi)線性良好，燈盞花基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的各物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)在0.9987～1.0000之間；土壤基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的各物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)在0.9880～0.9980之間。以信噪比(S/N)為3計算2種除草劑在燈盞花及其土壤中檢出限分別為3.00～4.10 ng/g、1.50～2.50 ng/g。

圖1 燈盞花(a)及其土壤(b)中2種除草劑的GC-MS色譜圖(1.0 μg/mL) Fig.1 The chromatograms of 2 compounds in E.breviscapus(Vant.) Hand-Mazz (a) and soil (b) by GC-MS (1.0 μg/mL) 1.Atrazine;2.Pendimethalin.

CompoundsRetentiontime/(min)Time window/(min)Quantitative and qualifying ions(intensity)RegressionequationLinear rang(mg/L)CorrelationcoefficientAtrazine5.9785.90～6.00200(100),215(59.5)Y=191.06X-817.950.05-2.01.0000Pendimethalin7.2687.20～7.30252(100),281(9.4)Y=158.41X-6730.20.05-2.00.9987

2.3 回收率實(shí)驗

2種除草劑在燈盞花中的添加水平為0.1、0.5、1.0 mg/L時的平均回收率在67.38%～104.02%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.21%～13.48%；2種除草劑在土壤中的添加水平為0.1、0.5、1.0 mg/L時的平均回收率在71.69%～105.58%之間，RSD為2.65%～18.26%。

2.4 方法應(yīng)用

用所建立的方法對采自云南省某燈盞花種植基地使用的兩種除草劑的4個燈盞花植株樣本，及其4個土壤樣本中農(nóng)藥殘留情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，所有燈盞花樣品中未檢測出阿特拉津，其中兩個燈盞花樣品(A、C)檢測出二甲戊樂靈，濃度分別為51.74±1.68 ng/g、39.11±6.19 ng/g。

4個土壤樣品中3個土壤樣品(A、B、D)檢測出阿特拉津，濃度分別為13.01±1.93 ng/g、35.60±8.95 ng/g、32.94±11.58 ng/g；所有土壤樣品(A、B、C、D)中檢測出二甲戊樂靈，濃度分別為275.90±38.94 ng/g、38.87±1.53 ng/g、556.87±13.90 ng/g、29.04±3.84 ng/g。

3 結(jié)論

本文通過以ASE前處理，弗羅里硅土柱層析凈化，以GC-MS-SIM為定性定量分析手段，建立了中草藥燈盞花中農(nóng)藥殘留的分析方法。研究結(jié)果表明：該方法在0.05～2.0 mg/L范圍線性關(guān)系好，精密度、準(zhǔn)確度以及檢出限等方面均能夠滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，可以為我國中草藥及土壤相關(guān)農(nóng)殘分析提供參考與借鑒。