潘宏程， 朱俊杰, 姜立萍*

(生命分析化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京 210093)

羅丹明類染料因具有光穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高，以及三線激發(fā)態(tài)形成程度較低等優(yōu)點(diǎn)，在化學(xué)與生物分析領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用[1，2]。利用該類染料與金屬離子形成離子締合物，發(fā)展了一系列測(cè)定金屬離子的萃取光度法和催化光度法[3，4]。利用羅丹明染料的熒光特性可建立高靈敏的熒光光度法[5，6]，也可以通過(guò)氧化活化使熒光增強(qiáng)，用于測(cè)定金屬離子[7]。

羅丹明類染料在水溶液中帶正電荷，能與磷鉬酸(PMA)根陰離子結(jié)合生成離子締合物。PMA與羅丹明B(RhB)、丙酮、明膠、聚乙烯醇等形成的有機(jī)溶劑膠束包合絡(luò)合物在592 nm波長(zhǎng)處顯色，可用于微量磷的測(cè)定[8]。劉保生等[9]利用十二烷基苯磺酸鈉存在下，吖啶橙-羅丹明6G(R6G)發(fā)生有效能量轉(zhuǎn)移，使R6G的熒光大大增強(qiáng)，而酸性條件下PMA與R6G形成的離子締合物使R6G的熒光猝滅，從而建立了測(cè)定痕量磷的能量轉(zhuǎn)移熒光法。蔣治良等[10]發(fā)現(xiàn)在硫酸介質(zhì)中，PMA與羅丹明S形成的締合物在610 nm處的共振光散射急劇增強(qiáng)，表明PMA-羅丹明S締合物有可能形成微納米級(jí)的結(jié)構(gòu)。在疏水作用力和靜電引力下，羅丹明類染料與PMA形成離子締合物后能進(jìn)一步形成大的微粒。羅丹明類染料分子聚集在締合物微粒中產(chǎn)生強(qiáng)烈的電子耦合效應(yīng)，導(dǎo)致共振增強(qiáng)的光散射現(xiàn)象。這類有機(jī)-無(wú)機(jī)雜化復(fù)合納米材料表現(xiàn)出優(yōu)異的光電性能和生物親和性，為高靈敏度的化學(xué)與生物分析提供了嶄新的研究思路。但是與其廣闊的應(yīng)用前景相比，羅丹明類染料-PMA復(fù)合納米材料的制備和性能的研究還相當(dāng)匱乏。

本研究制備了R6G -PMA和RhB-PMA復(fù)合納米微粒，并用掃描電鏡(SEM)、紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)吸收光譜、熒光光譜、共振光散射(RLS)光譜對(duì)復(fù)合納米微粒進(jìn)行了表征。制備了R6G -PMA修飾玻碳電極(R6G -PMA/GCE)，并研究了H2O2在R6G -PMA/GCE上的電化學(xué)行為，建立了一種測(cè)定H2O2的計(jì)時(shí)電流分析新方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

GHI660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司),采用三電極系統(tǒng):R6 G-PMA/GCE(Φ=3 mm)為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑柱電極為對(duì)電極。TGL-16型高速離心機(jī)(江蘇金壇市中大儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器有限公司)；KAWH古川9050超聲波清洗器；DHG -9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；8-S1型磁力攪拌器(江蘇金壇市環(huán)宇科技儀器廠)。

殼聚糖，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)(0.1 mol/L，pH=7.48)，羅丹明B(RhB)，羅丹明6G(R6G)(上海華藍(lán)化學(xué))；磷鉬酸(PMA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；抗壞血酸(0.001 mol/L，西隴化工有限公司)；H2O2(0.001 mol/L，西隴化工有限公司)；尿酸(0.001 mol/L，上海華藍(lán)化學(xué))。所用其它試劑均為分析純以上。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 羅丹明類染料-PMA復(fù)合納米微粒的制備

稱取0.1 mmol的RhB或R6G于100 mL燒杯中，加入40 mL乙醇，攪拌溶解。再稱取0.2 g PMA于另一燒杯中，加入10 mL二次水溶解。當(dāng)兩者分別溶解完全后，迅速混合，于40 ℃恒溫水浴中攪拌反應(yīng)2 h。自然冷卻后，以4 000 r/min離心5 min，沉淀用15 mL 50%的乙醇反復(fù)洗滌、離心，最后沉淀在40 ℃下烘干4 h，得到暗紅色的羅丹明類染料-PMA復(fù)合納米微粒。將干燥后的RhB-PMA和R6G -PMA復(fù)合納米微粒各取0.0065 g，超聲分散于5 mL 50%的乙醇中，待用。

1.3 R6G -PMA復(fù)合納米微粒修飾玻碳電極的制備

將玻碳電極(GCE)先用金相砂紙(1#～7#)逐級(jí)拋光，再依次用粒度為1.0、0.3、0.05 μm的α-Al2O3懸濁液在麂皮上拋光至鏡面。每次拋光后先洗去表面污物，再移入超聲水浴中清洗，每次2～3 min，重復(fù)三次，最后依次用乙醇(1+1)、HNO3(1+1)和二次水超聲清洗后，電極在0.5～1.0 mol/L的H2SO4中用循環(huán)伏安法活化(電位掃描范圍1.0～-0.2 V)，反復(fù)掃描直至達(dá)到穩(wěn)定的循環(huán)伏安曲線為止。然后在0.20 mol/L的KNO3溶液中記錄在1.0×10-3mol/L K3[Fe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安曲線，以測(cè)試電極性能。掃描速度50 mV/s，電位掃描范圍-0.2～0.9 V，所得循環(huán)伏安曲線中的峰電位差在80 mV以下。

將0.0065 g R6G-PMA復(fù)合納米材料超聲分散于5 mL 50%的乙醇中。移取100 μL該溶液與50 μL 1%殼聚糖溶液(溶于1%乙酸)混合均勻。滴加5 μL該混合溶液于已處理好的GCE表面，自然晾干，即得R6G -PMA/GCE。

2 結(jié)果與討論

2.1 掃描電子顯微鏡表征

圖1A為RhB-PMA復(fù)合納米微粒的掃描電鏡(SEM)照片。從圖中可以看出，RhB-PMA復(fù)合納米微粒表面光滑，呈近似球形和橢球形，堆積成三維有空隙的結(jié)構(gòu)。圖1B給出了隨機(jī)選取的50個(gè)RhB-PMA復(fù)合納米微粒的粒徑分布圖，其平均粒徑為343±144 nm。

圖1 RhB-PMA復(fù)合納米微粒的SEM圖(A)和粒徑分布圖(B)Fig.1 SEM image (A) and diameter distribution (B) of RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.2 紫外-可見(jiàn)吸收光譜

圖2為R6G、RhB、R6G -PMA和RhB-PMA在50%的乙醇中的紫外-可見(jiàn)(UV-Vis)吸收光譜。R6G和RhB的最大吸收峰分別為526 nm和553 nm(圖2A)。當(dāng)R6G、RhB與PMA形成復(fù)合納米微粒時(shí)，吸收峰分別紅移至562 nm和555 nm(圖2B)，表明R6G、RhB與PMA發(fā)生了締合作用。這種作用力可能主要來(lái)自R6G、RhB的正電荷與PMA所帶負(fù)電荷之間的靜電引力，以及R6G、RhB分子之間的疏水作用力。

圖2 (A)R6G、RhB的紫外-可見(jiàn)光譜；(B)R6G -PMA和RhB-PMA(b)復(fù)合納米微粒的紫外-可見(jiàn)光譜Fig.2 (A)UV-Vis spectra of R6G and RhB;(B)UV-Vis spectra R6G -PMA and RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.3 熒光和共振光散射光譜

R6G -PMA和RhB-PMA復(fù)合納米微粒都表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光性能。R6G -PMA和RhB-PMA納米微粒的熒光峰分別位于581 nm和580 nm，分別見(jiàn)圖3和圖4。與相應(yīng)的羅丹明類染料分子相比(R6G熒光峰為525 nm，RhB熒光峰為550 nm)，復(fù)合納米微粒的熒光峰都發(fā)生了紅移，這與吸收光譜的結(jié)果相符。進(jìn)一步研究了R6G -PMA和RhB-PMA復(fù)合納米微粒的共振光散射(RLS)效應(yīng)。結(jié)果表明，R6G和RhB溶液的RLS信號(hào)很微弱，這是因?yàn)镽6G和RhB染料分子在溶液中散射截面很小，主要為Rayleigh散射。但是R6G、RhB與PMA締合后，聚集成幾百納米的微粒，其RLS信號(hào)急劇增強(qiáng)，R6G -PMA和RhB-PMA分別在581 nm和654 nm產(chǎn)生最大RLS峰。

根據(jù)Parkash等人[11]用量子理論對(duì)染料聚集體引起的RLS增強(qiáng)現(xiàn)象的研究，聚集體的尺寸和電子耦合強(qiáng)度是影響RLS的主要因素。R6G -PMA和RhB-PMA復(fù)合納米微粒由于靜電引力和疏水作用力而發(fā)生聚集，形成粒徑可達(dá)數(shù)百納米的復(fù)合物微球(圖1)。在聚集體中，由于羅丹明類染料具有共軛大π鍵，相鄰染料分子之間強(qiáng)烈的電子耦合會(huì)導(dǎo)致很強(qiáng)的共振光散射現(xiàn)象。

圖3 R6G -PMA復(fù)合納米微粒的熒光(a)和共振光散射(b)光譜Fig.3 Fluorescence(a) and RLS(b) spectra of R6G -PMA hybrid nanoparticles

圖4 RhB-PMA復(fù)合納米微粒的熒光(a)和共振光散射(b)光譜Fig.4 Fluorescence (a) and RLS (b) spectra of RhB-PMA hybrid nanoparticles

2.4 R6G -PMA復(fù)合納米微粒修飾電極的H2O2傳感器

采用R6G -PMA復(fù)合納米微粒修飾GCE，構(gòu)建了一種新型的H2O2電化學(xué)傳感器。圖5A給出了不同濃度的H2O2在R6G -PMA/GCE上的循環(huán)伏安圖，支持電解質(zhì)為pH=7的0.1 mol/L PBS。無(wú)H2O2時(shí)，R6G -PMA/GCE上無(wú)明顯氧化電流產(chǎn)生；隨著H2O2的加入，R6G -PMA/GCE的氧化電流增大。由于裸GCE上H2O2的氧化電流很弱，因此R6G -PMA/GCE對(duì)H2O2的氧化有明顯的催化作用。

另外，采用計(jì)時(shí)電流法考察了R6G -PMA/GCE對(duì)H2O2的電流-時(shí)間(i-t)響應(yīng)情況(圖5B)。在0.9 V工作電位下，R6G -PMA/GCE對(duì)H2O2具有快速的響應(yīng)，信號(hào)達(dá)到95%的時(shí)間小于4 s，且當(dāng)H2O2濃度在3.3×10-6～5.6×10-5mol/L范圍內(nèi)時(shí)呈線性響應(yīng)(圖5C)，其線性方程為:I(μA)=1.366+0.1553c(10-6mol/L)，相關(guān)系數(shù)r2為0.9921，檢出限(3σ)為2.0×10-8mol/L。

同時(shí)，進(jìn)一步考察了常見(jiàn)干擾物質(zhì)尿酸(UA)和抗壞血酸(AA)對(duì)H2O2測(cè)定的影響(圖5D)。在H2O2濃度為3.3×10-6mol/L時(shí)，等量的UA和10倍的AA對(duì)H2O2測(cè)定的影響<1%。這說(shuō)明R6G -PMA/GCE對(duì)H2O2的測(cè)定有較好的選擇性。

圖5 (A)H2O2在R6G -PMA/GCE上的循環(huán)伏安圖；(B)R6G -PMA/GCE上持續(xù)加入3.3×10-6 mol/L H2O2的i -t響應(yīng)曲線；(C)催化電流與H2O2濃度的線性關(guān)系；(D)尿酸(UA)和抗壞血酸(AA)對(duì)H2O2測(cè)定的影響Fig.5 (A) Cyclic voltammograms of the R6G -PMA/GCE with different concentrations of H2O2;(B) i -t response curve for successive addition of 3.3×10-6 mol/L H2O2 for R6G -PMA/GCE in 0.1 mol/L PBS(pH=7) at the applied potential of 0.9 V;(C) Plots of the electrocatalytic current vs H2O2 concentration;(D) Effect of uric acid and ascorbic acid on the detection of H2O2

3 結(jié)論

合成了R6G -PMA和RhB-PMA兩種復(fù)合納米微粒，研究了羅丹明類染料-PMA復(fù)合納米微粒的光學(xué)性能，結(jié)果表明這一類復(fù)合納米微粒具有非常好的熒光和共振光散射增強(qiáng)效應(yīng)。羅丹明類染料與PMA通過(guò)靜電引力和疏水作用力相互結(jié)合，形成納米級(jí)的聚集體。在聚集體中，由于羅丹明類染料具有共軛大π鍵，相鄰染料分子之間強(qiáng)烈的電子耦合效應(yīng)會(huì)導(dǎo)致很強(qiáng)的共振光散射現(xiàn)象。這類復(fù)合納米微粒有望成為新型的熒光和RLS探針應(yīng)用于生物分子檢測(cè)、免疫標(biāo)記等領(lǐng)域。我們構(gòu)建了R6G -PMA/GCE的H2O2電化學(xué)傳感器。R6G -PMA/GCE對(duì)H2O2的氧化有明顯的催化作用，并且對(duì)尿酸和抗壞血酸有較好的抗干擾能力。