石書婷， 章曉娟， 易倫朝

(中南大學化學化工學院， 湖南長沙 410083)

代謝組學是通過考察生物體系受刺激或擾動后，其代謝產物的變化或其隨時間的變化研究生物體系的一門學科[1]。大量文獻已經報道，血漿[2，3]、血清[4]、尿液[5]、腦脊髓液[6]等生物體液都可作為代謝組學的分析對象。Denery等[7]提出血清中多肽類和蛋白質類成分比血漿中多。然而對于血清和血漿之間小分子代謝物的差異分析則鮮有報道。

氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用法因靈敏度高、重現性好及檢測限低等優(yōu)點而被廣泛應用于代謝組學研究[8，9]。夏鑫華等[10]采用硅烷化反應檢測了大鼠血液中的23種內源性代謝物。本文對肟化-硅烷化的柱前衍生法進行優(yōu)化，并用化學對照品對方法的重復性、精密度、回收率等進行考察，得到了準確可行的人體血清和血漿中代謝物的GC-MS分析方法。研究結果表明，血清、血漿中代謝物的種類和含量均有差異，為代謝組學研究中血清和血漿樣本的選擇提供了依據。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2010氣相色譜-質譜聯用儀(日本，島津公司)，島津氣質聯用工作站和NIST05質譜庫。

甲醇(99.95%，江蘇漢邦公司)；N,O -雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷(BSTFA+1%TMCS)，甲氧胺鹽酸鹽，吡啶，十七酸均購于美國Sigma公司，純度均為99.0%；β-羥基丁酸，焦谷氨酸，亞油酸，膽固醇均購于百靈威科技有限公司，純度均為99.0%。

1.2 樣本前處理

健康人血清、血漿樣本從-80 ℃低溫冰箱取出后，常溫下解凍，取100 μL置于1.5 mL離心管中，加入50 μL內標十七酸甲醇溶液(1 mg/mL)，渦旋15 s，再加入350 μL甲醇去除蛋白，渦旋1 min，靜置8 min，離心10 min(16 000 r/min,4 ℃)，取400 μL上清液置于試管中，N2吹干。加入50 μL甲氧胺吡啶(20 mg/mL)，渦旋15 s，70 ℃下肟化反應1 h后，加入100 μL硅烷化試劑(BSTFA+1%TMCS)，渦旋15 s，70 ℃水浴反應1 h后渦旋混勻，取1 μL進樣分析。

1.3 GC-MS分析條件

色譜柱：Agilent DB-5ms熔融石英毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：280 ℃；初始柱溫：70 ℃，保持4 min，以8 ℃/min程序升溫至300 ℃，保持3 min；柱流速：1 mL/min；分流比：10∶1；載氣：He；接口溫度：250 ℃。離子源(EI)溫度：200 ℃；質量范圍：m/z35～800；掃描間隔：0.2 s；電子倍增器電壓：0.9 kV；溶劑切除時間：6.5 min。

2 結果與討論

2.1 方法學考察

2.1.1線性關系考察精密稱取對照品β-羥基丁酸、焦谷氨酸、亞油酸、膽固醇適量，加甲醇定容，配成含β-羥基丁酸、焦谷氨酸、亞油酸、膽固醇均為5 mg/mL的混合對照品溶液。將配好的混合對照品溶液逐級稀釋成5.00、4.00、3.00、2.00、1.00、0.75、0.50、0.25、0.01 mg/mL系列混合標準品溶液。N2吹后進行兩步衍生，渦旋混勻后進樣1 μL測定。以樣品和內標的峰面積比值(y)為縱坐標，樣品的原始濃度(x,mg/mL)為橫坐標，進行線性回歸。結果表明，各對照品的響應強度與質量濃度均呈良好的線性關系，回歸系數均在0.99以上，能滿足檢測要求。

2.1.2重復性及精密度考察重復性試驗：平行制備同一混合標準品溶液5份進行兩步衍生后分別進樣，計算得到各物質的相對標準偏差(RSD)在1.80%～9.26%之間。精密度試驗：取同一混合標準品衍生后,1 d內(0、3、6、9、12 h)進樣5次，得到日內RSD在0.38%～3.61%之間；取同一混合標準品衍生后連續(xù)5 d同一時間進樣測定，得到日間RSD在2.65%～5.65%之間。結果表明，本文采用的分析方法對以β-羥基丁酸、焦谷氨酸、亞油酸、膽固醇為代表的代謝物來說是穩(wěn)定、準確和可靠的。

2.1.3回收率考察空白回收率試驗：根據標準曲線配制高、中、低濃度的混合標準品溶液，各種濃度均平行制備5份，肟化-硅烷化衍生后分別進樣，得到4種對照品的空白回收率分別為86.09%、94.84%、106.3%、92.58%，RSD依次為2.69%、3.49%、7.19%、1.22%；加標回收率試驗：根據樣本中代謝物的濃度配制混合標準品溶液，加入一定量的樣品，按1.2節(jié)所示平行制備5份進行處理后進樣，得到其加標回收率分別為84.64%、82.22%、92.61%、85.3%，RSD依次為5.81%、4.03%、5.26%、7.02%。結果顯示4種代謝物的回收率和相對標準偏差均符合方法學考察的要求。

2.2 血清血漿中代謝物差異的比較分析

2.2.1血清血漿中代謝物種類的差異分析從40個血清樣本和34個血漿樣本中共檢測出80多個代謝物，其中39個為血清和血漿中共有的(表1)。其中，20個為標準品定性，另外19個在NIST05質譜庫中檢索，相似度均≥85%。分析血清和血漿的總離子流圖(圖略)發(fā)現，保留時間28.035 min處，血漿中存在一個吲哚-3-乙酸峰，這也是血漿中特有的代謝物。除吲哚-3-乙酸峰外，該方法測定的血清和血漿中的代謝物基本相同，主要為脂肪酸、氨基酸、糖類、膽固醇等。

2.2.2血清血漿中代謝物含量的差異分析從表1 可知，在血清和血漿共有的39個代謝物中，有32個代謝物的含量有顯著性差異(T=1，p<0.5)，其中25個在血清中含量高于血漿，包括3種有機酸(乳酸、甘油酸和甘露糖酸)，11種氨基酸(丙氨酸、甘氨酸、正纈氨酸、L-纈氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、焦谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及苯丙氨酸)，5種脂肪酸(棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸)，2種糖類(半乳糖和乳糖)，3種醇類(肌酐烯醇、1,5-脫水山梨醇和肌醇)以及尿素；另外7種代謝物在血漿中的含量高于血清，包括4種有機酸(磷酸、2,3,4-三羥基丁酸、檸檬酸和尿酸)，2種糖類(果糖和吡喃葡萄糖苷)以及鳥氨酸。結果表明，代謝物在血清和血漿中的含量有顯著差別，對于大部分的氨基酸、脂肪酸和醇類，其血清中的含量均高于血漿；而有機酸和糖類在血清和血漿中的含量高低不一。

圖1 血清血漿的PLS-DA投影圖(a)和PLS-DA回歸系數圖(b)Fig.1 Projection plots of PLS-DA for the discrimination between serum and plasma(a) and absolute value of β of each metabolite for discrimination(b)*: β >0.18.

為了篩選出血清和血漿中關鍵的差異性代謝物，采用偏最小二乘判別分析法(PLS-DA)建立了健康人血清和血漿的判別模型。圖1(a)顯示了由血清和血漿中共有的39種代謝物建立的PLS-DA判別模型，得到血清和血漿的判別正確率均為100%。圖1(b)則是由PLS回歸系數篩選出的判別血清和血漿的重要變量(β>0.18，*標示)，5種代謝物分別為磷酸、異亮氨酸、2,3,4-三羥基丁酸、檸檬酸和硬脂酸。以這5個代謝物重新建立血清和血漿的PLS-DA判別模型，模型的正確率為100%。結果表明，這5個代謝物可以反映血清和血漿各自的代謝特征，是區(qū)別血清和血漿的關鍵代謝物。

表1 血清和血漿中內源性代謝物的含量

(續(xù)表1)

No.Retention time(min)CompoundConcentration(mg/mL)Serum(n=40)Plasma(n=39)TSerum>plasma3627.558Arachidonic acid*0.022±0.0060.010±0.0041Yes3730.11Glucopyranoside 0.012±0.0020.111±0.2451No3831.248Lactose*0.017±0.0070.007±0.0141Yes3935.171Cholesterol*0.463±0.0500.437±0.1080-

*Identified by standard substances.Data are presented as mean±SD by the ratio of its peaks area to that of the internal standard on the same chromatogram.A p value of <0.05 is considered statistically significant and signed T value is "1",otherwise "0".

3 結論

優(yōu)化的肟化-硅烷化方法結合GC-MS對血清和血漿中的有機酸、氨基酸、脂肪酸和膽固醇進行了方法學考察，結果表明該方法準確可行，適合于血清和血漿樣本的分析。通過對40個健康人血清樣本和34個健康人血漿樣本中代謝物種類和含量進行分析發(fā)現，吲哚-3-乙酸是血漿中的特有代謝物，T檢驗結果和PLS-DA分析均表明，血清和血漿在代謝物水平上有顯著性差異，磷酸、異亮氨酸、2,3,4-三羥基丁酸、檸檬酸和硬脂酸可能成為判別血清和血漿的重要指標。