賈 敏， 張亦凡， 張銀志， 孫秀蘭*,

( 1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122；3.陜西省漢中市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，陜西漢中 723000)

食物過(guò)敏是一個(gè)全球關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界約有1%～2%成人和5%～8%兒童對(duì)某些食物存在過(guò)敏反應(yīng)[1 - 3]。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO，1995)報(bào)告指出90%以上的食物過(guò)敏反應(yīng)由以下8大類常見(jiàn)食物誘發(fā)：牛奶、雞蛋、花生、堅(jiān)果、小麥、大豆、魚(yú)和貝類[4]。牛奶是其中最常見(jiàn)的過(guò)敏原之一，牛奶過(guò)敏(CMA)是由于攝入乳或含有乳制品的食物而引起的異常免疫反應(yīng)[5]，在3歲以內(nèi)兒童中引起廣泛的不良反應(yīng)，其發(fā)病率高達(dá)2%～7.5%[6，7]。牛奶蛋白含量豐富，理論而言天然牛奶含有的任何一種蛋白質(zhì)都有潛在致敏性，但酪蛋白(Casein,CN)、β-乳球蛋白(Beta-lactoglobulin,β-Lg)及α-乳白蛋白(Alpha-lactalbumin,α-La)被認(rèn)為是主要的牛奶過(guò)敏原[8，9]。α-乳白蛋白是由LALBA基因編碼的一種蛋白質(zhì)，是乳清蛋白中分子量最小的蛋白質(zhì)，其分子量約為14 000 Da,單體由123個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，是牛乳中一種重要的乳清蛋白[10]。α-乳白蛋白耐熱性較低，高溫可降低其致敏性，但是仍然可誘發(fā)嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)，被認(rèn)為是一種重要的牛乳過(guò)敏原[11,12]。

目前，防止食物過(guò)敏的唯一有效手段是避免食入過(guò)敏原[13]，因此對(duì)食物過(guò)敏原的檢測(cè)至關(guān)重要。至今為止，對(duì)食物過(guò)敏原的檢測(cè)方法主要針對(duì)致敏性蛋白和間接指示過(guò)敏原組分存在的DNA片段。免疫化學(xué)方法是目前最常用的過(guò)敏原檢測(cè)方法，可直接檢測(cè)出致敏性蛋白，但是其存在特異性抗體難獲得，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，加工過(guò)程酶、溫度、壓力對(duì)蛋白質(zhì)的破壞影響檢測(cè)等缺點(diǎn)[14，15]。DNA比較穩(wěn)定，食品加工對(duì)其影響較小，因而基于DNA的常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR可以作為蛋白檢測(cè)的補(bǔ)充方法。關(guān)瀟等人[16]建立了基于α-乳白蛋白基因的常規(guī)PCR定性檢測(cè)方法，但還未見(jiàn)α-乳白蛋白基因的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。

本研究建立了Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，用于食品中牛奶主要過(guò)敏原α-乳白蛋白基因的檢測(cè)，與常規(guī)PCR方法相比且具有靈敏、快速、簡(jiǎn)單、安全等優(yōu)點(diǎn)。與直接檢測(cè)致敏性蛋白的免疫分析方法相比，可大大降低復(fù)雜生物基質(zhì)中交叉反應(yīng)導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果，避免對(duì)大量抗體的需求，而DNA比蛋白穩(wěn)定，受食品加工過(guò)程影響較小，故可通過(guò)對(duì)過(guò)敏原DNA片段的檢測(cè)間接指示食物過(guò)敏原組分的存在。因此，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可作為目前常用的免疫檢測(cè)的有效補(bǔ)充，為食物牛奶過(guò)敏原的檢測(cè)提供可靠的保障，可推廣到實(shí)際食品中的牛奶過(guò)敏原檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

伯樂(lè)C1000TM型PCR儀(美國(guó)，Bio-rad(伯樂(lè))公司)；SLAN?全自動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(上海宏石醫(yī)療科技有限公司)；DYY-8C瓊脂糖凝膠電泳儀(北京六一制造廠)；TU-1900型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；凝膠成像儀(美國(guó),Bio-rad(伯樂(lè))公司)。

1.2 試劑與材料

pMD19T-vector，PCR膠回收試劑盒、DNA Ligation Kit、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒、 2X 熱啟動(dòng) PCR 試劑混合物，Takara公司。引物及探針：HPLC純化，由上海生工生物工程有限公司合成；溴化乙錠(EB)、TBE緩沖液、瓊脂糖，上海生工生物工程有限公司；Tris-飽和酚，氯仿、乙醇及異戊醇等其它分析純?cè)噭?，?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。感受態(tài)菌,氨芐青霉素,LB 培養(yǎng)基由上海博仕生物醫(yī)學(xué)服務(wù)中心(水源生物)提供。

光明鮮牛奶，現(xiàn)代鮮牛奶，特侖蘇鮮牛奶，復(fù)原乳(A)，麥芽牛乳(B)，高纖燕麥飲料(C)，花生牛乳飲料(D)，果粒奶優(yōu)(E)，均購(gòu)自歐尚超市。

1.3 DNA的提取

參照文獻(xiàn)方法[17，18]提取并稍加改動(dòng)。提取市售鮮牛奶中的DNA：(1)取50 mL鮮牛奶于4個(gè)100 mL的離心管中， 4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，用棉球去除上層乳蛋白和乳脂；(2)加入10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，溶解沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；(3)加入880 μL TEN(1 mL l mol/L Tris+0.2 mL 0.5 mol/L EDTA+58 g NaCl 定容至100 mL)和0.2 moI/L NaOH溶液120 μL，懸浮沉淀并震蕩混勻30 s，95 ℃條件下水浴8 min 期間顛倒混勻幾次,4 ℃、12 000 r/min離心10 min；(4)取上清液至滅菌離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1，劇烈震蕩2～3 min,4 ℃、12 000 r/min離心10 min；(5)取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，12 000 r/min離心10 min；(6)上清液移入滅菌離心管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，慢慢上下顛倒30 s,-20 ℃條件下放置30 min，12 000 r/min離心2 min，管底部有可見(jiàn)的白色DNA沉淀；(7)白色沉淀用70%乙醇洗滌2次，用N2吹干至無(wú)乙醇味；(8)加適量ddH2O溶解，測(cè)其濃度。

1.4 引物和探針設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI上已公布的牛奶過(guò)敏原α-乳白蛋白(α-La)基因(GenBank登錄號(hào)：AF249896.1)的核酸序列，設(shè)計(jì)合成檢測(cè)牛奶α-乳白蛋白成分的引物和Taqman-BHQ探針,PCR目標(biāo)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為236 bp,序列見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增用引物和探針序列

1.5 牛奶定性PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

用上述引物對(duì)3種不同來(lái)源牛奶的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，每種樣品都設(shè)置3種退火溫度梯度(50、55、60 ℃)，PCR擴(kuò)增總體系30 μL,PCR Mixture 2×Mix 15 μL,上下游引物各 0.5 μL(10 mmol/L),DNA模板 2 μL,余下體積用滅菌超純水補(bǔ)足至30 μL。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，即在30 μL PCR體系中用超純水代替DNA模板。PCR擴(kuò)增體系為，起始模板變性94 ℃，3 min；變性94 ℃，30 s；退火(50、55、60 ℃)，30 s，延伸72 ℃，30 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃延伸10 min。

將上述PCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)：將3 μL 6×Loading Buffer與6 μL PCR產(chǎn)物混合，加入1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，在TBE電泳緩沖液中進(jìn)行電泳，以DNA Maker 3 000作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，100 V電泳45 min，在凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.6 目的基因與載體的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定

1.6.1連接按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR膠回收純化，pMD18-T vecto進(jìn)行連接，10 μL連接體系為：PCR回收片段 4 μL，pMD18-T vector 1 μL，T4ligase 1 μL,10×T4ligase buffer 1 μL,H2O 3 μL。16 ℃ 1 h,然后4 ℃放置過(guò)夜。

1.6.2轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)菌中，冰浴20 min。42 ℃靜止水浴90 s，再冰浴2 min。加入1 mL無(wú)抗性的LB,37 ℃,150 r/min，復(fù)蘇40 min。12 000 r/min離心1 min,去掉1 mL上清，剩下的混勻涂帶有藍(lán)白斑篩選氨芐抗性的培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板放到培養(yǎng)箱中，37 ℃放置過(guò)夜。

1.6.3酶切鑒定和測(cè)序挑取白色菌落進(jìn)行小量培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒,用BamHI 與HindIII 進(jìn)行雙酶切,酶切后經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳鑒定,并將初步鑒定為陽(yáng)性的菌落接種LBA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后，將菌液送測(cè)序進(jìn)一步確證。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

定量PCR的引物和探針序列見(jiàn)表1，將重組質(zhì)粒pMD19T-La用HindIII單酶切成線性化的標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒并進(jìn)行定量，轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的拷貝數(shù)后按10倍倍比梯度稀釋：第一管取割膠產(chǎn)物10 μL到90 μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中，接下來(lái)都是10倍稀釋，稀釋成1.12×102～1.12×1011拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Taqman探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)。定量PCR反應(yīng)體系為：總體積為30 μL，其中含2×qPCR mix 15 μL，上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),探針1 μL(10 μmol/L)，模板DNA 2 μL，滅菌超純水11 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR運(yùn)行條件同定性PCR優(yōu)化好的條件：94 ℃，3 min； 94 ℃，30 s；55 ℃，30 s， 72 ℃，30 s檢測(cè)熒光信號(hào)，35個(gè)循環(huán)，72 ℃保溫10 min。以初始模板量的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以循環(huán)閾值(Ct)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

為對(duì)本研究建立的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的實(shí)際應(yīng)用性進(jìn)行考察，對(duì)5種市售實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)。利用上述改進(jìn)的牛奶基因組DNA提取方法對(duì)5種市售液體樣品進(jìn)行基因組DNA提取，以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其α-乳白蛋白過(guò)敏原基因拷貝數(shù)，利用檢測(cè)限來(lái)判斷液體樣品是否含有牛奶α-乳白蛋白過(guò)敏原。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶基因組DNA的提取

經(jīng)測(cè)定提取的基因組DNA的OD260/OD280均在1.7左右， DNA純度較好，濃度較高，可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。樣品基因組DNA測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣本基因組DNA測(cè)定值

圖1 不同牛奶基因組DNA及退火溫度的定性PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR products from extracted genomic DNA of three commercial milk with different annealing temperatureM．DNA Maker DL1000;1-3.Bright milk,annealing temperature(50,55,60 ℃);4-5.Modern milk,annealing temperature(50,55,60 ℃);6-9.Deluxe milk,annealing temperature(50,55,60 ℃);N:Negative control.

2.2 PCR定性分析

分別以提取的光明、現(xiàn)代、特侖蘇鮮牛奶基因組DNA為模板進(jìn)行定性PCR檢測(cè)， PCR的電泳結(jié)果(圖1)表明，通過(guò)本研究設(shè)計(jì)的引物可從商業(yè)牛奶基因組DNA中擴(kuò)增出牛的α-乳白蛋白的預(yù)期條帶,不同的退火溫度相差不大，我們選用55 ℃進(jìn)行后續(xù)定量的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。根據(jù)此結(jié)果將擴(kuò)增得到的PCR條帶進(jìn)行割膠回收做T/A克隆構(gòu)建pMD19T-La載體。

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定和測(cè)序鑒定

將回收α-La基因片段PCR產(chǎn)物連接到pMD19T載體上，提取重組子質(zhì)粒，進(jìn)行BamHI與HindIII酶切鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒所得插人片段約為236 bp，與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致。進(jìn)一步將克隆的PCR產(chǎn)物構(gòu)建質(zhì)粒pMD19T-La進(jìn)行DNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI上的blast進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果表明克隆的序列與GenBank中已登錄的牛的α-乳白蛋白基因序列一致。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)克隆的序列為牛奶α-乳白蛋白基因序列。標(biāo)準(zhǔn)模板測(cè)序結(jié)果如圖2所示。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

將重組質(zhì)粒pMD19T-La用HindIII進(jìn)行單酶切，回收線性化的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行定量。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋成10個(gè)濃度作為擴(kuò)增模板，每個(gè)梯度重復(fù)3次測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在1.12×108～1.12×103拷貝數(shù)范圍內(nèi)，Ct值與模板DNA分子的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系(圖3)，以基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=-4.1289x+50.9768(R2=0.9994)。式中：y為循環(huán)閾值(Cycle Threshold，Ct)；x為質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和樣品的Ct值便可計(jì)算出樣品中所測(cè)組分DNA的含量。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)模板α -乳白蛋白基因片段DNA測(cè)序結(jié)果Fig.2 DNA sequence analysis of α -La allergen gene fragment as a standard template

圖3 標(biāo)準(zhǔn)模板質(zhì)粒pMD19T-La DNA 系列梯度的擴(kuò)增曲線Fig.3 Establishment of amplification curve for detection of α -La DNA template by real-time PCR1-6:template concentration:1.12×103,1.12×104,1.12×105,1.12×106,1.12×107,1.12×108 copies.

圖4 PCR擴(kuò)增特異性Fig.4 Specificity of PCR amplificationM.DNA Maker DL1000；1.soybean;2.milk;3.peanut;4.shrimp;5.wheat;6.sesame.

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1檢測(cè)限為考察實(shí)際樣品α-乳白蛋白的殘留量，對(duì)該方法的檢出限進(jìn)行分析。將上述光明鮮牛奶進(jìn)行梯度稀釋，提取DNA含量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算出每毫升液體樣品可檢測(cè)出的最低起始DNA模板拷貝數(shù)，以此來(lái)判斷實(shí)際樣品的牛奶過(guò)敏原DNA含量。對(duì)各個(gè)梯度的光明鮮牛奶稀釋液進(jìn)行基因組DNA提取，超純水溶解后以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對(duì)應(yīng)的基因拷貝數(shù)。結(jié)果分析得出每毫升液體樣品可檢測(cè)到的α-乳白蛋白基因最低拷貝數(shù)為1 000，即檢測(cè)限為1 000 copies/mL。

2.5.2特異性分析為考察所建立的Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè)法是否能特異性針對(duì)牛奶α-乳白蛋白基因，以鮮牛奶基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，提取大豆，花生，河蝦，小麥，芝麻常見(jiàn)食物過(guò)敏原基因組DNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示僅鮮牛奶基因組DNA擴(kuò)增出目的片段，其他5種常見(jiàn)基因組DNA擴(kuò)增均成陰性，見(jiàn)圖4。說(shuō)明建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有較好的特異性。

2.5.3重復(fù)性分析同一質(zhì)粒樣本選擇濃度1.12×104、1.12×106、1.12×108copies進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性分析。批內(nèi)：每一濃度樣品各一份同時(shí)進(jìn)行3次平行測(cè)定分析組內(nèi)重復(fù)性；組間：每一濃度樣品各一份6 d內(nèi)對(duì)3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品分別單獨(dú)進(jìn)行3次Taqman 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定，結(jié)果如表3所示，組內(nèi)Ct的變異系數(shù)(CV)均在2%以內(nèi)，組間CV均少于5%，說(shuō)明建立的牛奶α-乳白蛋白Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法穩(wěn)定性較好。

表3 組內(nèi)、組間重復(fù)性結(jié)果

圖5 市售食品中牛奶過(guò)敏原α -乳白蛋白的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)圖Fig.5 Detection of real-time PCR for α -La from commercial samples1.Reconstituted milk;2.Wheat germ milk;3.Fiber cereal drink;4.Peanut milk beverage.

2.6 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本研究建立的熒光定量PCR方法對(duì)5種商業(yè)液體樣品中的牛奶主要過(guò)敏原α-乳白蛋白基因進(jìn)行檢測(cè)。利用改進(jìn)的CTAB法對(duì)5種樣品的基因組DNA進(jìn)行提取，進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5所示。待檢食品其中4種均出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35,則判斷樣品中檢出過(guò)敏原α-乳白蛋白成分，與標(biāo)簽一致。E品牌果粒奶優(yōu)無(wú)擴(kuò)增曲線，牛奶α-乳白蛋白成分檢測(cè)為陰性，推測(cè)該飲料中雖然含有牛奶制品但量極少以至于過(guò)敏原α-乳白蛋白DNA含量極低，未能進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算食品中牛奶α-乳白蛋白的基因DNA拷貝數(shù)，結(jié)果如表4所示。

表4 市售食品中牛奶過(guò)敏原α -乳白蛋白的檢測(cè)結(jié)果

Postive：≥1 000 copies/mL;Negative：≤1 000 copies/mL.

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了特異性引物和探針，對(duì)目標(biāo)基因α-乳白蛋白的一段DNA序列進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，構(gòu)建重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，在1.12×108～1.12×103拷貝數(shù)范圍內(nèi)，Ct值與質(zhì)粒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值呈線性關(guān)系，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對(duì)目的基因濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。用本研究設(shè)計(jì)的引物和探針對(duì)幾種常見(jiàn)的食物過(guò)敏原進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示該檢測(cè)方法特異性針對(duì)α-乳白蛋白，同時(shí)該方法對(duì)液體樣品的檢測(cè)限達(dá)到1 000 copies/mL。利用本研究建立的熒光定量PCR對(duì)5種市售液體樣品進(jìn)行檢測(cè)，4種樣品出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，可得出每種樣品中α-乳白蛋白的水平，1種檢測(cè)結(jié)果為陰性，未檢測(cè)到α-乳白蛋白目的基因，推測(cè)其α-乳白蛋白含量較低，不能進(jìn)行有效擴(kuò)增。