周麗華， 唐連鳳， 鄧慧敏

(1.廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東廣州 510006；2.中山大學(xué)測試中心，廣東廣州 510275)

基質(zhì)在基質(zhì)輔助激光解吸電離/質(zhì)譜(MALDI/MS)表征生物分子、合成聚合物及其他小分子量物質(zhì)中起到不可代替的輔助作用。但基質(zhì)在激光作用下也會發(fā)生電離、裂解以及聚合等復(fù)雜的化學(xué)行為，導(dǎo)致MALDI譜圖中出現(xiàn)與基質(zhì)相關(guān)的質(zhì)譜峰。Ehring 等[1]研究了60多種基質(zhì)自身的MALDI行為；郝春雁等[2]對常用基質(zhì)2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、α-腈基-4-羥基肉桂酸(CCA)和芥子酸(SA)的MALDI/MS也進(jìn)行了研究。此外，基質(zhì)還易于與堿金屬離子如Na+、K+等結(jié)合，產(chǎn)生金屬加合峰?；|(zhì)相關(guān)峰可干擾出現(xiàn)在m/z500～2 000范圍的目標(biāo)物，如寡聚物或小分子量物質(zhì)(脂類、蛋白質(zhì)酶解液)等的譜峰分析[3]?；|(zhì)相關(guān)峰中對分析物影響最為顯著的是基質(zhì)簇峰?；|(zhì)簇峰的產(chǎn)生與許多因素有關(guān)，如基質(zhì)本身的性質(zhì)、基質(zhì)/樣品溶液的鹽濃度、pH值、基質(zhì)與樣品相對含量以及激光強(qiáng)度等。Keller 等[4]曾較系統(tǒng)地研究了CCA分析多肽混合物稀溶液時產(chǎn)生基質(zhì)簇峰的情況；Reilly 等[5]采用CCA分析蛋白質(zhì)酶解液能較好區(qū)別出基質(zhì)簇峰、多肽峰。

本文主要對測定DNA的常用基質(zhì)3-羥基吡啶甲酸(3-HPA)，以及測定高分子聚合物的常用基質(zhì)2-(4-羥基苯基偶氮)苯甲酸(HABA)、反式-3-吲哚基丙烯酸(IAA)和1,8,9-三羥基蒽(Dithranol)在LDI/MS 中產(chǎn)生基質(zhì)簇峰的情況進(jìn)行了研究和分析，考察了基質(zhì)溶劑、濃度及激光強(qiáng)度對基質(zhì)本身在LDI過程中產(chǎn)生基質(zhì)簇峰的影響；對基質(zhì)簇峰可能形成的過程進(jìn)行了推測；對各基質(zhì)簇峰進(jìn)行了歸屬，并提出了基質(zhì)簇離子峰m/z值遵循的計算公式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及參數(shù)

REFLEXTMⅢ型MALDI-TOF質(zhì)譜儀(德國，Bruker 公司)。氮激光器，激光波長337 nm，脈沖2 ns，延遲時間為200 ns。加速、反射器和檢測器電壓分別為20、23和1.55 kV。正離子反射檢測模式。儀器激光強(qiáng)度設(shè)定為0%～100%。所用激光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于引導(dǎo)激發(fā)閾值(激光強(qiáng)度閾值為能夠重復(fù)產(chǎn)生樣品譜峰所需的最低激光強(qiáng)度)。 譜圖平均累加激光點(diǎn)數(shù)為50～100。

1.2 試劑

3-羥基吡啶甲酸(3-HPA)、2-(4-羥基苯基偶氮)苯甲酸(HABA)、反式-3-吲哚基丙烯酸(IAA)和1,8,9-三羥基蒽(Dithranol)，均購自Aldrich公司(美國)，使用前未進(jìn)行任何前處理。3-HPA分別采用水、乙腈(ACN)-0.1 mol·L-1的檸檬酸氫二銨(DHC)(體積比1∶1)，及ACN-0.1%三氟乙酸(TFA)(體積比7∶3)配成5、10、15 mg/mL或飽和溶液。 HABA、IAA和Dithranol分別采用四氫呋喃(THF)和二甲基甲酰胺(DMF)配成0.2 mol·L-1溶液或飽和溶液。其它試劑均購自廣州試劑一廠。樣品和試劑均為分析純。

1.3 操作步驟

直接取1 μL基質(zhì)溶液置于樣品靶點(diǎn)上，室溫干燥結(jié)晶，送入離子源后進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同溶劑體系和基質(zhì)濃度對3-HPA基質(zhì)簇峰的影響

3-HPA為測定DNA樣品的基質(zhì)，也用于測定糖類物質(zhì)、磷酸化蛋白質(zhì)[6]等。實(shí)驗(yàn)對3-HPA的水、 ACN-0.1%TFA及ACN-0.1 mol·L-1DHC的不同濃度溶液，在一定激光激發(fā)下產(chǎn)生基質(zhì)簇峰的情況進(jìn)行了研究。圖1為3-HPA飽和水溶液及ACN-DHC飽和溶液的基質(zhì)簇峰圖。由圖1a可知，圖中相鄰主峰之間的m/z差值為161，該值比3-HPA基質(zhì)的相對分子質(zhì)量(MW3-HPA=139)大22?？赏茰y，3-HPA在形成基質(zhì)簇峰的過程中,主要由基質(zhì)分子中的活潑H+首先與溶液中的Na+進(jìn)行交換，生成相應(yīng)的Na鹽(M-H+Na)，然后由基質(zhì)鈉鹽分子在MALDI過程中產(chǎn)生一系列相關(guān)的基質(zhì)簇峰。圖1(b)與圖1(a)相比，最大基質(zhì)簇峰離子的m/z值為873.2；主要基質(zhì)簇相鄰峰差值為139，恰為一個3-HPA基質(zhì)的相對分子質(zhì)量。表1為3-HPA在三種不同溶劑體系中產(chǎn)生的部分基質(zhì)簇峰的歸屬。

圖1 3-HPA(H2O)(a)和3-HPA(ACN-DHC)(b)的基質(zhì)簇峰圖Fig.1 Matrix-cluster peaks of 3-HPA(H2O)(a)and 3-HPA(ACN-DHC)(b)

Matrix systemm/zm/zCluster=nM3-HPA-xH+yK+zNaIon of matrix-cluster3-HPA989.2n=6,x=6,y=0,z=76(3-HPA)-6H+7Na(H2O)1 005.1n=6,x=6,y=1,z=6 6(3-HPA)-6H+K+6Na1 150.1n=7,x=7,y=0,z=87(3-HPA)-7H+8Na1 166.1n=7,x=7,y=1,z=7 7(3-HPA)-7H+K+7Na1 311.0n=8,x=8,y=0,z=98(3-HPA)-8H+9Na1 327.0n=8,x=8,y=1,z=8 8(3-HPA)-8H+K+8Na3-HPA506.4n=3,x=3,y=0,z=43(3-HPA)-3H+4Na(ACN-TFA)667.4n=4,x=4,y=0,z=54(3-HPA)-4H+5Na828.3n=5,x=5,y=0,z=65(3-HPA)-5H+6Na989.2n=6,x=6,y=0,z=76(3-HPA)-6H+7Na1 150.1n=7,x=7,y=0,z=87(3-HPA)-7H+8Na3-HPA595.4n=4,x=0,y=1,z=04(3-HPA)+K(ACN-DHC)734.3n=5,x=0,y=1,z=05(3-HPA)+K873.2n=6,x=0,y=1,z=06(3-HPA)+K

3-HPA產(chǎn)生的基質(zhì)簇峰m/z值均遵循Keller 等[4]提出的CCA在正離子模式下的規(guī)律：

m/zCluster=nM-xH+yK+zNa

(1)

式中，x=y+z-1，y+z≤n+1，n=1，2，3，…，y或z=0，1，2，3,…，M為基質(zhì)分子。

3-HPA在ACN-TFA溶液中產(chǎn)生的基質(zhì)簇峰圖與其在飽和水溶液中產(chǎn)生的基質(zhì)簇峰圖相似。但3-HPA的ACN-TFA飽和溶液相對水溶液較難產(chǎn)生基質(zhì)簇峰，表現(xiàn)為在相對高的激光強(qiáng)度(50%)下，特別是在低于m/z500的區(qū)域中雜峰更少。另外，可檢測到的基質(zhì)簇峰相關(guān)峰(S/N>3)最大值為m/z1 150,遠(yuǎn)小于水溶液可檢測到的值m/z2 500。由此可知，在基質(zhì)溶液體系中，有機(jī)溶劑的參與雖然增加了3-HPA的溶解性，但同時可大大減少固體基質(zhì)所含鹽分的溶入，在一定程度上可減少基質(zhì)簇峰的產(chǎn)生[7]。表1列出了圖1中擴(kuò)展圖中基質(zhì)簇峰可能的歸屬?？芍?，3-HPA的ACN-DHC飽和溶液產(chǎn)生的m/zCluster值雖然仍遵循Keller 等總結(jié)的CCA的m/zCluster公式，但與3-HPA水溶液產(chǎn)生3-HPA鈉鹽的形式形成的基質(zhì)簇峰不同，其主要由3-HPA分子自身簇合而成。DHC是MAlDI測定DNA時常用的基質(zhì)添加劑之一[8]，可控制堿金屬加合物的形成和防止分析物裂解[9]。DHC的存在可大大減少基質(zhì)中鹽的影響，可有效抑制鈉鹽參與的基質(zhì)簇峰的形成。

2.2 不同激光強(qiáng)度對3-HPA基質(zhì)簇峰的影響

實(shí)驗(yàn)對不同溶劑的3-HPA基質(zhì)體系，分別考察了不同激光強(qiáng)度對基質(zhì)簇峰產(chǎn)生的影響。對于3-HPA水溶液體系，獲得分子離子峰[3-HPA+H]+(m/z140)所需激光強(qiáng)度為25%。 隨著激光強(qiáng)度的增加，大于m/z140的峰逐漸產(chǎn)生，可觀察到的基體簇峰m/z值(S/N>3)范圍逐漸增大。當(dāng)激光強(qiáng)度>45%時，可觀察到基體簇峰m/z范圍基本不變，小于m/z500的譜峰進(jìn)一步增加，使譜圖變得更復(fù)雜難解；對于3-HPA的ACN-TFA溶液體系，獲得分子離子峰的激光強(qiáng)度為10%。激光強(qiáng)度>50%時，基體簇峰m/z范圍基本不變；對于3-HPA ACN-DHC溶液體系，獲得分子離子峰的激光強(qiáng)度為15%,激光強(qiáng)度>80%時基體簇峰m/z范圍基本不變。由上可知，三種不同的基質(zhì)溶液體系中，ACN-TFA與ACN-DHC體系產(chǎn)生基質(zhì)簇峰所需激光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于激光強(qiáng)度閾值，適當(dāng)調(diào)節(jié)激光強(qiáng)度更易控制基質(zhì)簇峰的產(chǎn)生。含TFA的基質(zhì)體系可以更低的激光強(qiáng)度獲得分子離子峰，這可能是由于TFA可促進(jìn)3-HPA溶解，并在正離子模式下可作為質(zhì)子源提供體輔助3-HPA，以[3-HPA+H]+解吸/電離的緣故。

2.3 不同溶劑體系及激光強(qiáng)度對高分子聚合物常用基質(zhì)的簇峰的影響

實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)研究了在LDI正離子模式下，HABA、IAA和Dithranol在不同溶劑體系及不同激光強(qiáng)度下產(chǎn)生相關(guān)基質(zhì)峰的情況。結(jié)果表明，HABA、IAA和Dithranol飽和溶液比非飽和溶液更易產(chǎn)生基質(zhì)簇峰，在DMF溶劑中比在THF中更易在較低的激光強(qiáng)度下獲得最大m/z基質(zhì)簇峰。獲得HABA分子離子峰[HABA+H]+(m/z243)所需激光強(qiáng)度為15%，激光強(qiáng)度>60%時，可以觀察到基體簇峰m/z范圍基本不變，小于m/z400的譜峰區(qū)域雜峰變得更多，每組簇峰峰數(shù)增多，譜圖變得更復(fù)雜難解；獲得IAA飽和溶液的分子離子峰[IAA+H]+(m/z188)所需激光強(qiáng)度為15%，激光強(qiáng)度接近20%時，可以觀察到m/z144出現(xiàn)；激光強(qiáng)度>50%時，可以觀察到m/z值相差143的離子簇峰產(chǎn)生；激光強(qiáng)度>75%時，此類簇峰m/z范圍基本不變，小于m/z600的譜峰區(qū)域雜峰變得更多。獲得Dithranol飽和溶液的分子離子峰[Dithranol+H]+(m/z227)所需激光強(qiáng)度為10%，當(dāng)激光強(qiáng)度>90%時可以觀察到基體簇峰m/z范圍基本不變，小于m/z600的譜峰區(qū)域雜峰變多，獲得的譜峰分辨率同時也大大減低。圖2為HABA( DMF)的基質(zhì)簇峰圖。HABA(DMF)基質(zhì)簇峰的m/z值與CCA的m/zCluster值遵循相同的計算公式。圖2中的一組主峰中，相鄰兩峰之間的m/z差值為264，該值比HABA基質(zhì)的分子質(zhì)量(MWHABA=242)大22。由此推測，HABA在形成基質(zhì)簇峰的過程中,主要由基質(zhì)分子中的活潑H+首先與溶液中的Na+離子進(jìn)行交換反應(yīng)，生成相應(yīng)的Na鹽(M-H+Na)，然后由基質(zhì)鈉鹽分子在MALDI過程中產(chǎn)生一系列相關(guān)的基質(zhì)簇峰。圖3和表2分別為IAA(DMF)的基質(zhì)簇峰圖和IAA譜圖中各基質(zhì)簇峰的歸屬。圖中相鄰兩峰的m/z差值為143，比IAA的分子質(zhì)量(187)小44，根據(jù)譜圖中m/z值和IAA分子結(jié)構(gòu)推測，這些m/z值相差143的離子簇峰由IAA的脫羧產(chǎn)物簇合而成。IAA在MALDI過程中的脫羧反應(yīng)如下：

圖2 HABA(DMF)的基質(zhì)簇峰圖Fig.2 Matrix-cluster peaks of HABA(DMF)

圖3 IAA( DMF)的基質(zhì)簇峰圖Fig.3 Matrix-cluster peaks of IAA( DMF)

m/zm/zCluster=3MIAA+p[M-CO2]+NaIon of matrix-cluster584.4p=03IAA+Na727.5p=13IAA+[IAA-CO2]+Na870.4p=23IAA+2[IAA-CO2]+Na1 013.3p=33IAA+3[IAA-CO2]+Na1 156.2p=43IAA+4[IAA-CO2]+Na1 299.2p=53IAA+5[IAA-CO2]+Na

IAA分子在形成基質(zhì)簇時，首先是自身分子之間相簇合(如m/z584.4為3IAA+Na)。當(dāng)簇合分子數(shù)達(dá)到3個后，再逐漸與IAA的脫羧產(chǎn)物[IAA-CO2]簇合產(chǎn)生一系列的基質(zhì)簇峰。IAA這種特殊基質(zhì)簇峰的產(chǎn)生可能主要與其分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。由IAA(DMF)的基質(zhì)簇離子的歸屬可知，其m/zCluster值既不符合Keller 等[4]總結(jié)的CCA基質(zhì)簇峰數(shù)值規(guī)律，也不符合其總結(jié)的DHB基質(zhì)簇峰數(shù)值規(guī)律：

m/zCluster=nM+p[M-H2O]-xH+yK+zNa

(2)

式中,x=y+z-1,y+z≤n+p+1，n或p=1，2，3,…，n+p> 0，y或z=0，1，2，3,…。

(IAA(DMF)的基質(zhì)簇離子m/zCluster值遵循以下公式：

m/zCluster=3M+p[M-CO2]+Na

(3)

其中，M為IAA基質(zhì)分子，p=0，1，2，3，…。

圖4 Dithranol(DMF)的基質(zhì)簇峰圖Fig.4 Matrix-cluster peaks of dithranol(DMF)

圖4和表3分別為Dithranol的DMF溶液的基質(zhì)簇峰圖和擴(kuò)展圖中離子峰的歸屬。圖中顯示的一組強(qiáng)基質(zhì)簇峰的相鄰兩峰之間的m/z差值為226，恰與Dithranol的分子質(zhì)量相符。每個強(qiáng)峰的右邊都有一個m/z值比其大14的小峰。根據(jù)m/z值和Dithranol分子結(jié)構(gòu)推測，這些小峰可能是Dithranol基質(zhì)簇與一個Dithranol氧化物結(jié)合后產(chǎn)生的離子峰。Dithranol及其相關(guān)衍生物分子結(jié)構(gòu)上10位的亞甲基可在相應(yīng)條件下氧化為羰基[10]。在MALDI過程，Dithranol在激光的作用下氧化生成了分子質(zhì)量比其大14的氧化產(chǎn)物，即1,8-二羥基蒽醌。氧化反應(yīng)如下：

Dithranol(DMF)的m/zCluster值也不遵循Keller等[4]總結(jié)的規(guī)律。其遵循規(guī)律可總結(jié)為：

m/zCluster=nM+p[Onidate of M]+H

(4)

其中,M為Dithranol基質(zhì)分子，n=1，2，3,…，p=0，1。

表3 Dithranol的DMF溶液基質(zhì)簇擴(kuò)展圖離子峰的歸屬

3 結(jié)論

從上述對MALDI的四種常用基質(zhì)的基質(zhì)簇峰的研究結(jié)果可知，基質(zhì)在LDI中的行為比較復(fù)雜，充分了解所用基質(zhì)在LDI-TOF/MS中的行為，識別及正確解析基質(zhì)簇峰，無疑有助于取得更準(zhǔn)確的分析結(jié)果。