鹽脅迫對(duì)鹽生杜氏藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊懀?/h1>
2015-10-16 03:43:28王帥，梁英
關(guān)鍵詞：研究
王 帥，梁 英
（1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003；2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東 青島266061；3.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003）
鹽度是影響海洋微藻生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子，鹽度的高低必然會(huì)促進(jìn)或抑制海洋微藻的生長(zhǎng)，直接或間接影響其光合作用和呼吸作用。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［1－4］，鹽度會(huì)通過(guò)多條途徑來(lái)影響植物光合作用，例如：離子脅迫和滲透脅迫，高鹽條件下還會(huì)造成水分平衡的紊亂、影響光合電子傳遞效率和CO2同化作用。傳統(tǒng)方法確定微藻生存鹽度和最適生長(zhǎng)鹽度范圍是通過(guò)比較微藻在不同鹽度條件下的細(xì)胞密度，耗時(shí)較多［5］。為了解決這一問題，國(guó)外某些學(xué)者利用植物體內(nèi)葉綠素作為天然探針，在黑暗環(huán)境中適應(yīng)數(shù)分鐘，然后置于適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光下，通過(guò)檢測(cè)植物發(fā)出的隨時(shí)間變化的微弱熒光信號(hào)（Kautsky效應(yīng)）來(lái)測(cè)定微藻對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍［6］。
利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可對(duì)植物進(jìn)行活體測(cè)定和診斷，這一方法具有快速、準(zhǔn)確和需要樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，目前，采用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)研究不同鹽度對(duì)高等植物光合作用影響的報(bào)道相對(duì)較多，但由于實(shí)驗(yàn)材料、生長(zhǎng)階段和處理時(shí)間等因素的不同，研究結(jié)果不太一致。Singh等［7］研究結(jié)果表明鹽脅迫能促進(jìn)PSII的功能；而Allakhverdiev等［8］研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會(huì)抑制PSII的功能；Qia等［9］報(bào)道鹽脅迫對(duì)PSII的功能沒有造成明顯的影響。迄今為止，有關(guān)鹽脅迫對(duì)植物葉綠素?zé)晒馓匦杂绊懸延休^多的報(bào)道［10－14］，但目前還未見鹽脅迫對(duì)高耐鹽藻株—鹽生杜氏藻葉綠素?zé)晒馓匦杂绊懙膱?bào)道。
鹽生杜氏藻是綠藻門中唯一一種無(wú)細(xì)胞壁的單細(xì)胞海洋微藻，是高鹽環(huán)境中常見藻株，具有很強(qiáng)的耐鹽性，因其富含胡蘿卜素和甘油而逐漸受到重視，近年來(lái)已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于環(huán)境脅迫的研究［15］。本文采用Water－PAM葉綠素?zé)晒鈨x研究不同鹽濃度對(duì)1株具有很好的耐受高鹽脅迫特性的鹽生杜氏藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，以期為篩選耐鹽微藻藻株提供重要的方法，并為揭示鹽生杜氏藻光合作用抵抗鹽脅迫時(shí)的響應(yīng)機(jī)制提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 藻種
實(shí)驗(yàn)所用鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）（代號(hào)MACC／C43）藻種來(lái)源于中國(guó)海洋大學(xué)藻種庫(kù)。
1.2 微藻培養(yǎng)及鹽脅迫處理
培養(yǎng)采用f／2培養(yǎng)基［16］，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光照強(qiáng)度為100μmol·m－2·s－1，采用連續(xù)光照進(jìn)行培養(yǎng)。
在250mL的錐形瓶中進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的鹽生杜氏藻離心洗滌后，以2.08×104個(gè)／mL的接種量分別培養(yǎng)在不同鹽度的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液鹽度設(shè)定為5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130等梯度，每個(gè)鹽度3個(gè)平行組。培養(yǎng)過(guò)程中隨機(jī)調(diào)換錐形瓶并搖動(dòng)3次／d。在接種12、24和48h后取樣，測(cè)定鹽生杜氏藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素含量。
1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉綠素含量的測(cè)定及數(shù)據(jù)處理
按照王帥等［13］的方法，采用 Water－PAM 葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行熒光參數(shù)和葉綠素含量的測(cè)定。
采用Origin Pro8.0軟件進(jìn)行作圖。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行多因子方差分析（鹽度、脅迫時(shí)間以及二者的交互作用（鹽度×?xí)r間））和相關(guān)性分析。
2 結(jié)果
2.1 鹽度對(duì)鹽生杜氏藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
圖1和表1給出了鹽度和脅迫時(shí)間對(duì)鹽生杜氏藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。表1（a）的多因子方差分析結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，鹽度和脅迫時(shí)間對(duì)鹽生杜氏藻的熒光參數(shù) Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR、qP 和NPQ均有顯著影響（P＜0.001），其中鹽度對(duì)參數(shù)Fv／Fm、Fv／Fo和 qP 的 影 響 更 顯 著，而 脅 迫 時(shí) 間 對(duì)rETR和NPQ的影響更顯著。表1（b）給出的多重比較結(jié)果表明，F(xiàn)v／Fm、ΦPSII和Fv／Fo值在鹽度100時(shí)最高，但在鹽度20～110范圍內(nèi)無(wú)顯著性差異；rETR值在鹽度為60時(shí)達(dá)到最高；qP值在鹽度為5時(shí)最高；NPQ值則在鹽度為90時(shí)最高。脅迫時(shí)間對(duì)該藻的上述6個(gè)熒光參數(shù)值均有顯著影響，各參數(shù)值均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。
鹽生杜氏藻的熒光參數(shù)與鹽度之間的相關(guān)性見表2，鹽度在5～70之間的范圍內(nèi)，脅迫12和48h后，鹽生杜氏藻的Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR與鹽度呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，脅迫48h后qP與鹽度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。NPQ在脅迫12h時(shí)與鹽度無(wú)明顯的相關(guān)性，在脅迫24和48h時(shí)，該參數(shù)與鹽度呈極顯著正相關(guān)；鹽度在70～130范圍內(nèi)時(shí)，熒光參數(shù)Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR 以及qP均與鹽度呈極顯著的負(fù)相關(guān)性；脅迫12h后，NPQ與鹽度呈顯著的負(fù)相關(guān)；脅迫24h后，NPQ與鹽度呈極顯著的負(fù)相關(guān)；脅迫48h后與鹽度無(wú)明顯的相關(guān)性。
圖1 鹽度對(duì)鹽生杜氏藻熒光參數(shù)、細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of salinity on the fluorescence parameters，cell density and chlorophyll content of D.salina
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表2 鹽生杜氏藻熒光參數(shù)、細(xì)胞密度及葉綠素含量與鹽度的相關(guān)系數(shù)Table 2 The interrelated coefficients of fluorescence parameters，cell density and chlorophyll content with salinity of D.salina
2.2 鹽度對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響
圖1和表1給出了鹽度和脅迫時(shí)間對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響。表1（a）的多因子方差分析表明，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，鹽度、脅迫時(shí)間及其交互作用對(duì)該藻的葉綠素含量和細(xì)胞密度均產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.001），脅迫時(shí)間對(duì)上述2個(gè)參數(shù)的影響最為顯著。表1（b）給出的多重比較結(jié)果表明，鹽度在5～100之間的范圍內(nèi)，48h后隨著鹽度的升高，細(xì)胞密度和葉綠素含量的值明顯增加，且均在鹽度100時(shí)達(dá)到最大值；鹽度在100～130之間時(shí)，上述2個(gè)參數(shù)的值隨鹽度升高而逐漸降低。鹽生杜氏藻的細(xì)胞密度和葉綠素含量數(shù)值均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。
表3給出的鹽生杜氏藻的熒光參數(shù)與細(xì)胞密度之間的相關(guān)關(guān)系，由表3可見，鹽生杜氏藻的Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR與細(xì)胞密度呈極顯著的正相關(guān)；脅迫12和24h后，qP和NPQ與細(xì)胞密度的相關(guān)性較差，qP和NPQ在脅迫48h后與細(xì)胞密度呈顯著的正相關(guān)性。
表3 鹽生杜氏藻熒光參數(shù)及葉綠素含量與細(xì)胞密度的相關(guān)系數(shù)Table 3 The interrelated coefficient of fluorescence parameters and chlorophyll content with cell density of D.salina
3 討論
作為一種研究植物光合功能的新型植物活體檢測(cè)和診斷技術(shù)，葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在測(cè)定植物光合作用的過(guò)程中，利用植物中葉綠素作為天然探針，在光能的吸收、傳遞、分配和耗散等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并且其快速、靈敏、不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。國(guó)際上對(duì)葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)的研究已成為熱點(diǎn)，并針對(duì)耐寒性、耐熱性、耐強(qiáng)光性和耐鹽性等多種逆境生理?xiàng)l件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在研究植物逆境生理方面有許多優(yōu)勢(shì)［17－19］，但有關(guān)鹽脅迫對(duì)微藻光合作用影響的研究不多［12－13，20－22］。Fv／Fm比值是 PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，可以反映PSII的活性大小。正常生理狀態(tài)下參數(shù)Fv／Fm很穩(wěn)定，浮游植物Fv／Fm值保持在0.65左右［23］，該參數(shù)不具有種間特異性，但植物受到脅迫后，F(xiàn)v／Fm值會(huì)明顯降低。有研究結(jié)果表明，微藻在鹽脅迫條件下，其PSII的活性會(huì)降低，反映在Fv／Fm會(huì)隨鹽度的增加而下降。畢永紅等［20］研究發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)液中NaCl濃度的增加，發(fā)狀念珠藻（Nostoc flagelliforme）Fv／Fm比值逐漸降低，歐陽(yáng)葉新等［21］對(duì)魚腥藻（Anabaenasp.）的研究也得到了相似的結(jié)果。而陳蘭周等［22］的實(shí)驗(yàn)表明，爪哇偽枝藻（Scytonema javanicum）對(duì)鹽脅迫則很敏感，在0.1mol／L NaCl時(shí)Fv／Fm比值已下降至0.4左右。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽生杜氏藻有很強(qiáng)的耐鹽性，適宜鹽度范圍為20～110，在此鹽度范圍之間，F(xiàn)v／Fm比值無(wú)明顯降低，當(dāng)?shù)望}脅迫（鹽度＜20）和高鹽脅迫（鹽度＞110）條件下，F(xiàn)v／Fm比值才開始逐漸降低。鹽脅迫條件下，鹽生杜氏藻的PSII熒光指標(biāo)Fv／Fo、rETR 與Fv／Fm具有相同 的 變 化 趨勢(shì)，可見鹽生杜氏藻自身光系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換能力較強(qiáng)。ΦPSII的變化，反映的是藻細(xì)胞同化力（NADPH，ATP）的形成，即碳的固定與同化作用，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在鹽度20～110之間，不影響鹽生杜氏藻對(duì)CO2的固定和同化。qP（光化學(xué)淬滅）的變化表明，吸收的光能用于電子傳遞，當(dāng)qP降低時(shí)表示進(jìn)行光合作用的電子正在減少，以熱的形式耗散的光能會(huì)逐漸增加，這與NPQ（非光化學(xué)淬滅）的變化是吻合的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對(duì)熒光指標(biāo)（qP和NPQ）都造成了一定程度的抑制作用。
有關(guān)微藻耐鹽機(jī)制的研究，主要集中在光合色素和蛋白含量等方面。Rafiqul［24］等研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻（Spirulina fusiformis）葉綠素a含量隨著NaCl濃度的增加而降低。藍(lán)藻（S.fusiformis）在較低NaCl濃度條件下，類胡蘿卜素含量降低；而在較高NaCl濃度條件下，其類胡蘿卜素含量增加。耐鹽藍(lán)藻（Anabaena doliolum）的葉綠素含量則隨著NaCl濃度的增加而增加［7］。鹽脅迫下，藻藍(lán)蛋白（PC）含量的變化結(jié)果較為一致，集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803在鹽處理下，PC含量明顯降低［25］；藍(lán)藻（S.fusiformis）的 PC含量隨鹽濃度的增加而降低［24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽度為20～110條件下，鹽脅迫不僅不會(huì)對(duì)耐鹽的鹽生杜氏藻造成損傷，反而會(huì)促進(jìn)其生長(zhǎng)，48h后隨著鹽度的升高，細(xì)胞密度和葉綠素含量逐漸增加，鹽度為100時(shí)，二者均達(dá)到最大值。但超過(guò)一定鹽度范圍（＞110）后，高鹽脅迫對(duì)鹽生杜氏藻的PSII會(huì)產(chǎn)生傷害，主要表現(xiàn)在加速了藻體中葉綠素含量的降低（見圖1），可能高鹽（＞110）會(huì)影響類囊體膜的穩(wěn)定性，加速葉綠素的分解，從而降低PSII反應(yīng)中心的光合速率。目前對(duì)于微藻耐鹽機(jī)制的研究還不是十分清楚，僅從某一方面研究其耐鹽性還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，這有待于進(jìn)行深入研究。
鹽生杜氏藻屬于水產(chǎn)動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)餌料之一，但可能由于微藻藻株、培養(yǎng)條件等因素的不同，目前對(duì)鹽生杜氏藻適鹽范圍的報(bào)道并不一致。吳春［26］報(bào)道鹽生杜氏藻（D.salina）的最適鹽度范圍為20～30。而呂愛玲等［27］對(duì)中國(guó)渤海灣灘涂的綠色杜氏藻進(jìn)行鹽度馴化實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為綠色杜氏藻可在9～320的鹽度范圍生長(zhǎng)，能耐受接近飽和的鹽度條件。本文的研究結(jié)果表明，鹽生杜氏藻對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍很廣，在鹽度20～110時(shí)，F(xiàn)v／Fm值無(wú)顯著性差異，這表明鹽度20～110均適于鹽生杜氏藻的生長(zhǎng)，與之前利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)對(duì)塔胞藻［13］的研究結(jié)果相比，本研究篩選得到的這株鹽生杜氏藻（D.salina）具有更好的耐鹽性，在高鹽條件下更有利于對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。即使鹽度在5～20之間的低鹽脅迫條件下，F(xiàn)v／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR、細(xì)胞密度和葉綠素含量等一系列指標(biāo)均在逐漸增加（見圖1），這也是該藻株對(duì)鹽度較強(qiáng)適應(yīng)性的一種表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽生杜氏藻在鹽度5～110之間均能生長(zhǎng)，最適鹽度為100。本文的結(jié)果表明，鹽生杜氏藻PSII的熒光指標(biāo)（Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR）與細(xì)胞密度均呈極顯著的正相關(guān)性，而且細(xì)胞密度也與葉綠素含量呈極顯著的正相關(guān)性，因此，在一定范圍內(nèi)，可通過(guò)該藻PSII熒光指標(biāo)的變化反映其細(xì)胞密度及葉綠素含量對(duì)鹽脅迫的耐受性。與計(jì)數(shù)細(xì)胞密度的傳統(tǒng)方法相比，葉綠素?zé)晒夥治龇椒ǜ涌焖佟㈧`敏和準(zhǔn)確，并且不會(huì)對(duì)藻細(xì)胞造成損傷［28－29］。
現(xiàn)已證明，PSII的熒光指標(biāo)更能反映植物的內(nèi)在性特點(diǎn)，因此，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)已成為篩選高等植物（擬南芥、枸杞，特別是小麥等）耐鹽品種的一種理想手段［1，4，14］。本文的結(jié)果表明，篩選得到的鹽生杜氏藻其耐鹽性很好，該藻 PSII的熒光指標(biāo)（Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR）與細(xì)胞密度具有良好的正相關(guān)關(guān)系，可用于該藻鹽脅迫耐受性的評(píng)價(jià)依據(jù)，但目前對(duì)這方面研究的微藻品種還較少，PSII的熒光指標(biāo)作為篩選耐鹽微藻的參考指標(biāo)是否可行，有待針對(duì)不同的微藻品種和品系進(jìn)行全面的實(shí)驗(yàn)研究，以確定該方法的適應(yīng)范圍及可靠性。
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王 帥，梁 英
（1.中國(guó)海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003；2.國(guó)家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東 青島266061；3.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島266003）
鹽度是影響海洋微藻生長(zhǎng)的重要環(huán)境因子，鹽度的高低必然會(huì)促進(jìn)或抑制海洋微藻的生長(zhǎng)，直接或間接影響其光合作用和呼吸作用。大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［1－4］，鹽度會(huì)通過(guò)多條途徑來(lái)影響植物光合作用，例如：離子脅迫和滲透脅迫，高鹽條件下還會(huì)造成水分平衡的紊亂、影響光合電子傳遞效率和CO2同化作用。傳統(tǒng)方法確定微藻生存鹽度和最適生長(zhǎng)鹽度范圍是通過(guò)比較微藻在不同鹽度條件下的細(xì)胞密度，耗時(shí)較多［5］。為了解決這一問題，國(guó)外某些學(xué)者利用植物體內(nèi)葉綠素作為天然探針，在黑暗環(huán)境中適應(yīng)數(shù)分鐘，然后置于適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光下，通過(guò)檢測(cè)植物發(fā)出的隨時(shí)間變化的微弱熒光信號(hào)（Kautsky效應(yīng)）來(lái)測(cè)定微藻對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍［6］。
利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)可對(duì)植物進(jìn)行活體測(cè)定和診斷，這一方法具有快速、準(zhǔn)確和需要樣品量少等優(yōu)點(diǎn)，目前，采用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)研究不同鹽度對(duì)高等植物光合作用影響的報(bào)道相對(duì)較多，但由于實(shí)驗(yàn)材料、生長(zhǎng)階段和處理時(shí)間等因素的不同，研究結(jié)果不太一致。Singh等［7］研究結(jié)果表明鹽脅迫能促進(jìn)PSII的功能；而Allakhverdiev等［8］研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會(huì)抑制PSII的功能；Qia等［9］報(bào)道鹽脅迫對(duì)PSII的功能沒有造成明顯的影響。迄今為止，有關(guān)鹽脅迫對(duì)植物葉綠素?zé)晒馓匦杂绊懸延休^多的報(bào)道［10－14］，但目前還未見鹽脅迫對(duì)高耐鹽藻株—鹽生杜氏藻葉綠素?zé)晒馓匦杂绊懙膱?bào)道。
鹽生杜氏藻是綠藻門中唯一一種無(wú)細(xì)胞壁的單細(xì)胞海洋微藻，是高鹽環(huán)境中常見藻株，具有很強(qiáng)的耐鹽性，因其富含胡蘿卜素和甘油而逐漸受到重視，近年來(lái)已被國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于環(huán)境脅迫的研究［15］。本文采用Water－PAM葉綠素?zé)晒鈨x研究不同鹽濃度對(duì)1株具有很好的耐受高鹽脅迫特性的鹽生杜氏藻生長(zhǎng)及葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，以期為篩選耐鹽微藻藻株提供重要的方法，并為揭示鹽生杜氏藻光合作用抵抗鹽脅迫時(shí)的響應(yīng)機(jī)制提供參考依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 藻種
實(shí)驗(yàn)所用鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）（代號(hào)MACC／C43）藻種來(lái)源于中國(guó)海洋大學(xué)藻種庫(kù)。
1.2 微藻培養(yǎng)及鹽脅迫處理
培養(yǎng)采用f／2培養(yǎng)基［16］，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為（20±1）℃，光照強(qiáng)度為100μmol·m－2·s－1，采用連續(xù)光照進(jìn)行培養(yǎng)。
在250mL的錐形瓶中進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn)，將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的鹽生杜氏藻離心洗滌后，以2.08×104個(gè)／mL的接種量分別培養(yǎng)在不同鹽度的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液鹽度設(shè)定為5，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130等梯度，每個(gè)鹽度3個(gè)平行組。培養(yǎng)過(guò)程中隨機(jī)調(diào)換錐形瓶并搖動(dòng)3次／d。在接種12、24和48h后取樣，測(cè)定鹽生杜氏藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)、細(xì)胞密度和葉綠素含量。
1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉綠素含量的測(cè)定及數(shù)據(jù)處理
按照王帥等［13］的方法，采用 Water－PAM 葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行熒光參數(shù)和葉綠素含量的測(cè)定。
采用Origin Pro8.0軟件進(jìn)行作圖。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行多因子方差分析（鹽度、脅迫時(shí)間以及二者的交互作用（鹽度×?xí)r間））和相關(guān)性分析。
2 結(jié)果
2.1 鹽度對(duì)鹽生杜氏藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響
圖1和表1給出了鹽度和脅迫時(shí)間對(duì)鹽生杜氏藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響。表1（a）的多因子方差分析結(jié)果表明，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，鹽度和脅迫時(shí)間對(duì)鹽生杜氏藻的熒光參數(shù) Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR、qP 和NPQ均有顯著影響（P＜0.001），其中鹽度對(duì)參數(shù)Fv／Fm、Fv／Fo和 qP 的 影 響 更 顯 著，而 脅 迫 時(shí) 間 對(duì)rETR和NPQ的影響更顯著。表1（b）給出的多重比較結(jié)果表明，F(xiàn)v／Fm、ΦPSII和Fv／Fo值在鹽度100時(shí)最高，但在鹽度20～110范圍內(nèi)無(wú)顯著性差異；rETR值在鹽度為60時(shí)達(dá)到最高；qP值在鹽度為5時(shí)最高；NPQ值則在鹽度為90時(shí)最高。脅迫時(shí)間對(duì)該藻的上述6個(gè)熒光參數(shù)值均有顯著影響，各參數(shù)值均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高。
鹽生杜氏藻的熒光參數(shù)與鹽度之間的相關(guān)性見表2，鹽度在5～70之間的范圍內(nèi)，脅迫12和48h后，鹽生杜氏藻的Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR與鹽度呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系，脅迫48h后qP與鹽度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。NPQ在脅迫12h時(shí)與鹽度無(wú)明顯的相關(guān)性，在脅迫24和48h時(shí)，該參數(shù)與鹽度呈極顯著正相關(guān)；鹽度在70～130范圍內(nèi)時(shí)，熒光參數(shù)Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR 以及qP均與鹽度呈極顯著的負(fù)相關(guān)性；脅迫12h后，NPQ與鹽度呈顯著的負(fù)相關(guān)；脅迫24h后，NPQ與鹽度呈極顯著的負(fù)相關(guān)；脅迫48h后與鹽度無(wú)明顯的相關(guān)性。
圖1 鹽度對(duì)鹽生杜氏藻熒光參數(shù)、細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of salinity on the fluorescence parameters，cell density and chlorophyll content of D.salina
?
表2 鹽生杜氏藻熒光參數(shù)、細(xì)胞密度及葉綠素含量與鹽度的相關(guān)系數(shù)Table 2 The interrelated coefficients of fluorescence parameters，cell density and chlorophyll content with salinity of D.salina
2.2 鹽度對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響
圖1和表1給出了鹽度和脅迫時(shí)間對(duì)鹽生杜氏藻細(xì)胞密度和葉綠素含量的影響。表1（a）的多因子方差分析表明，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，鹽度、脅迫時(shí)間及其交互作用對(duì)該藻的葉綠素含量和細(xì)胞密度均產(chǎn)生了顯著影響（P＜0.001），脅迫時(shí)間對(duì)上述2個(gè)參數(shù)的影響最為顯著。表1（b）給出的多重比較結(jié)果表明，鹽度在5～100之間的范圍內(nèi)，48h后隨著鹽度的升高，細(xì)胞密度和葉綠素含量的值明顯增加，且均在鹽度100時(shí)達(dá)到最大值；鹽度在100～130之間時(shí)，上述2個(gè)參數(shù)的值隨鹽度升高而逐漸降低。鹽生杜氏藻的細(xì)胞密度和葉綠素含量數(shù)值均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。
表3給出的鹽生杜氏藻的熒光參數(shù)與細(xì)胞密度之間的相關(guān)關(guān)系，由表3可見，鹽生杜氏藻的Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR與細(xì)胞密度呈極顯著的正相關(guān)；脅迫12和24h后，qP和NPQ與細(xì)胞密度的相關(guān)性較差，qP和NPQ在脅迫48h后與細(xì)胞密度呈顯著的正相關(guān)性。
表3 鹽生杜氏藻熒光參數(shù)及葉綠素含量與細(xì)胞密度的相關(guān)系數(shù)Table 3 The interrelated coefficient of fluorescence parameters and chlorophyll content with cell density of D.salina
3 討論
作為一種研究植物光合功能的新型植物活體檢測(cè)和診斷技術(shù)，葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)在測(cè)定植物光合作用的過(guò)程中，利用植物中葉綠素作為天然探針，在光能的吸收、傳遞、分配和耗散等方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，并且其快速、靈敏、不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成損傷。國(guó)際上對(duì)葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)的研究已成為熱點(diǎn)，并針對(duì)耐寒性、耐熱性、耐強(qiáng)光性和耐鹽性等多種逆境生理?xiàng)l件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)在研究植物逆境生理方面有許多優(yōu)勢(shì)［17－19］，但有關(guān)鹽脅迫對(duì)微藻光合作用影響的研究不多［12－13，20－22］。Fv／Fm比值是 PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，可以反映PSII的活性大小。正常生理狀態(tài)下參數(shù)Fv／Fm很穩(wěn)定，浮游植物Fv／Fm值保持在0.65左右［23］，該參數(shù)不具有種間特異性，但植物受到脅迫后，F(xiàn)v／Fm值會(huì)明顯降低。有研究結(jié)果表明，微藻在鹽脅迫條件下，其PSII的活性會(huì)降低，反映在Fv／Fm會(huì)隨鹽度的增加而下降。畢永紅等［20］研究發(fā)現(xiàn)，隨培養(yǎng)液中NaCl濃度的增加，發(fā)狀念珠藻（Nostoc flagelliforme）Fv／Fm比值逐漸降低，歐陽(yáng)葉新等［21］對(duì)魚腥藻（Anabaenasp.）的研究也得到了相似的結(jié)果。而陳蘭周等［22］的實(shí)驗(yàn)表明，爪哇偽枝藻（Scytonema javanicum）對(duì)鹽脅迫則很敏感，在0.1mol／L NaCl時(shí)Fv／Fm比值已下降至0.4左右。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鹽生杜氏藻有很強(qiáng)的耐鹽性，適宜鹽度范圍為20～110，在此鹽度范圍之間，F(xiàn)v／Fm比值無(wú)明顯降低，當(dāng)?shù)望}脅迫（鹽度＜20）和高鹽脅迫（鹽度＞110）條件下，F(xiàn)v／Fm比值才開始逐漸降低。鹽脅迫條件下，鹽生杜氏藻的PSII熒光指標(biāo)Fv／Fo、rETR 與Fv／Fm具有相同 的 變 化 趨勢(shì)，可見鹽生杜氏藻自身光系統(tǒng)的轉(zhuǎn)換能力較強(qiáng)。ΦPSII的變化，反映的是藻細(xì)胞同化力（NADPH，ATP）的形成，即碳的固定與同化作用，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在鹽度20～110之間，不影響鹽生杜氏藻對(duì)CO2的固定和同化。qP（光化學(xué)淬滅）的變化表明，吸收的光能用于電子傳遞，當(dāng)qP降低時(shí)表示進(jìn)行光合作用的電子正在減少，以熱的形式耗散的光能會(huì)逐漸增加，這與NPQ（非光化學(xué)淬滅）的變化是吻合的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對(duì)熒光指標(biāo)（qP和NPQ）都造成了一定程度的抑制作用。
有關(guān)微藻耐鹽機(jī)制的研究，主要集中在光合色素和蛋白含量等方面。Rafiqul［24］等研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)藻（Spirulina fusiformis）葉綠素a含量隨著NaCl濃度的增加而降低。藍(lán)藻（S.fusiformis）在較低NaCl濃度條件下，類胡蘿卜素含量降低；而在較高NaCl濃度條件下，其類胡蘿卜素含量增加。耐鹽藍(lán)藻（Anabaena doliolum）的葉綠素含量則隨著NaCl濃度的增加而增加［7］。鹽脅迫下，藻藍(lán)蛋白（PC）含量的變化結(jié)果較為一致，集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803在鹽處理下，PC含量明顯降低［25］；藍(lán)藻（S.fusiformis）的 PC含量隨鹽濃度的增加而降低［24］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在鹽度為20～110條件下，鹽脅迫不僅不會(huì)對(duì)耐鹽的鹽生杜氏藻造成損傷，反而會(huì)促進(jìn)其生長(zhǎng)，48h后隨著鹽度的升高，細(xì)胞密度和葉綠素含量逐漸增加，鹽度為100時(shí)，二者均達(dá)到最大值。但超過(guò)一定鹽度范圍（＞110）后，高鹽脅迫對(duì)鹽生杜氏藻的PSII會(huì)產(chǎn)生傷害，主要表現(xiàn)在加速了藻體中葉綠素含量的降低（見圖1），可能高鹽（＞110）會(huì)影響類囊體膜的穩(wěn)定性，加速葉綠素的分解，從而降低PSII反應(yīng)中心的光合速率。目前對(duì)于微藻耐鹽機(jī)制的研究還不是十分清楚，僅從某一方面研究其耐鹽性還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，這有待于進(jìn)行深入研究。
鹽生杜氏藻屬于水產(chǎn)動(dòng)物的優(yōu)質(zhì)餌料之一，但可能由于微藻藻株、培養(yǎng)條件等因素的不同，目前對(duì)鹽生杜氏藻適鹽范圍的報(bào)道并不一致。吳春［26］報(bào)道鹽生杜氏藻（D.salina）的最適鹽度范圍為20～30。而呂愛玲等［27］對(duì)中國(guó)渤海灣灘涂的綠色杜氏藻進(jìn)行鹽度馴化實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為綠色杜氏藻可在9～320的鹽度范圍生長(zhǎng)，能耐受接近飽和的鹽度條件。本文的研究結(jié)果表明，鹽生杜氏藻對(duì)鹽度的適應(yīng)范圍很廣，在鹽度20～110時(shí)，F(xiàn)v／Fm值無(wú)顯著性差異，這表明鹽度20～110均適于鹽生杜氏藻的生長(zhǎng)，與之前利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)對(duì)塔胞藻［13］的研究結(jié)果相比，本研究篩選得到的這株鹽生杜氏藻（D.salina）具有更好的耐鹽性，在高鹽條件下更有利于對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。即使鹽度在5～20之間的低鹽脅迫條件下，F(xiàn)v／Fm、ΦPSII、Fv／Fo、rETR、細(xì)胞密度和葉綠素含量等一系列指標(biāo)均在逐漸增加（見圖1），這也是該藻株對(duì)鹽度較強(qiáng)適應(yīng)性的一種表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽生杜氏藻在鹽度5～110之間均能生長(zhǎng)，最適鹽度為100。本文的結(jié)果表明，鹽生杜氏藻PSII的熒光指標(biāo)（Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR）與細(xì)胞密度均呈極顯著的正相關(guān)性，而且細(xì)胞密度也與葉綠素含量呈極顯著的正相關(guān)性，因此，在一定范圍內(nèi)，可通過(guò)該藻PSII熒光指標(biāo)的變化反映其細(xì)胞密度及葉綠素含量對(duì)鹽脅迫的耐受性。與計(jì)數(shù)細(xì)胞密度的傳統(tǒng)方法相比，葉綠素?zé)晒夥治龇椒ǜ涌焖佟㈧`敏和準(zhǔn)確，并且不會(huì)對(duì)藻細(xì)胞造成損傷［28－29］。
現(xiàn)已證明，PSII的熒光指標(biāo)更能反映植物的內(nèi)在性特點(diǎn)，因此，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)已成為篩選高等植物（擬南芥、枸杞，特別是小麥等）耐鹽品種的一種理想手段［1，4，14］。本文的結(jié)果表明，篩選得到的鹽生杜氏藻其耐鹽性很好，該藻 PSII的熒光指標(biāo)（Fv／Fm、ΦPSII、Fv／Fo和rETR）與細(xì)胞密度具有良好的正相關(guān)關(guān)系，可用于該藻鹽脅迫耐受性的評(píng)價(jià)依據(jù)，但目前對(duì)這方面研究的微藻品種還較少，PSII的熒光指標(biāo)作為篩選耐鹽微藻的參考指標(biāo)是否可行，有待針對(duì)不同的微藻品種和品系進(jìn)行全面的實(shí)驗(yàn)研究，以確定該方法的適應(yīng)范圍及可靠性。
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