馬鵬飛，蒙堅，周靜，高海軍

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重組大腸桿菌利用D-木糖合成D-1,2,4-丁三醇

馬鵬飛，蒙堅，周靜，高海軍

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院，北京100081）

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol, BT）是一種重要的有機(jī)合成中間體。通過克隆表達(dá)惡臭假單胞菌（ATCC12633）2-酮酸脫羧酶（）和新月柄桿菌（CB15）D-木糖脫氫酶（），敲除木糖利用和D-1,2,4-丁三醇合成中間代謝物分解途徑中關(guān)鍵基因木糖異構(gòu)酶（）和2-酮酸醛縮酶（和），重構(gòu)大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)，得到了能夠?qū)-木糖轉(zhuǎn)化為D-1,2,4-丁三醇的重組菌株?？疾炝藴囟取⒀b液量、pH控制等條件對重組菌株合成D-1,2,4-丁三醇的影響，在適宜條件下發(fā)酵36 h后D-1,2,4-丁三醇產(chǎn)量達(dá)到3.96 g·L-1。探討了葡萄糖利用與丁三醇合成的關(guān)系，通過敲除編碼酶IICBGlc的基因改造重組菌株的磷酸烯醇式丙酮酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶（phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system, PTS）系統(tǒng)，菌株可以在利用葡萄糖生長的同時進(jìn)行木糖的轉(zhuǎn)化，具有更高的合成能力。

D-1,2,4-丁三醇；PTS系統(tǒng)；代謝；生物催化；合成生物學(xué)

引 言

1,2,4-丁三醇（1,2,4-butanetriol, BT）是一種類似甘油的C4平臺化合物，廣泛應(yīng)用于軍工、醫(yī)藥、煙草、化妝品、造紙、農(nóng)業(yè)和高分子材料等領(lǐng)域[1-4]。其硝化而成的丁三醇三硝酸酯（BTTN）是一種高能增塑劑[5-6]。丁三醇可用于合成陽離子脂質(zhì)體[7]、抗病毒[8-9]和抗腫瘤[2]藥物、高彈性的聚氨酯泡 沫[10]、還可用作可消除硝基化合物對人體的毒害、減少焦油成分危害的卷煙添加劑，以及可增加色彩度和黏著力的彩色顯影液添加劑[11]。目前丁三醇的生產(chǎn)主要采用NaBH4還原蘋果酸二酯[12-13]或銣和碳催化蘋果酸加氫[1]等化學(xué)合成法。這些方法反應(yīng)條件苛刻，環(huán)境污染嚴(yán)重，收率低，提純難度大[1]。

隨著生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，代謝工程、合成生物學(xué)技術(shù)逐漸成熟并廣泛應(yīng)用，化學(xué)品的生物合成成為目前研究的熱點(diǎn)[14]。2003年，F(xiàn)rost實(shí)驗(yàn)室Niu[1]在大腸桿菌（）中構(gòu)建了異源代謝途徑，可以D-木糖酸和L-阿拉伯糖酸為底物合成1,2,4-丁三醇對映體，產(chǎn)量為2.4 g·L-1。在此基礎(chǔ)上，Valdehuesa等[10]敲除大腸桿菌的木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶（）、2-酮酸醛縮酶（和）基因并過量表達(dá)來自新月柄桿菌（）的木糖脫氫酶（）以及來自惡臭假單胞菌（）密碼子優(yōu)化后的2-酮酸脫羧酶（），重組菌可直接將D-木糖轉(zhuǎn)化為D-1,2,4-丁三醇，產(chǎn)量為0.88 g·L-1。2014年，Li等[15]在大腸桿菌中構(gòu)建了以葡萄糖為底物經(jīng)蘋果酸合成1,2,4-丁三醇的代謝途徑。以上研究多集中于合成途徑的構(gòu)建，生物合成過程的研究還較少。

本工作在構(gòu)建D-1,2,4-丁三醇合成工程菌的基礎(chǔ)上研究了培養(yǎng)條件對D-1,2,4-丁三醇合成的影響，探討了葡萄糖的利用與以木糖為前體生物合成D-1,2,4-丁三醇的關(guān)系，改造了底物利用方式，在一定程度上提高了重組菌株合成D-1,2,4-丁三醇的能力。

1 材料和方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

本工作所用菌株及質(zhì)粒列于表1。大腸桿菌（.MG1655，.DH5α）、新月柄桿菌（.CB15）惡臭假單胞菌（.ATCC12633）以及P1噬菌體均為實(shí)驗(yàn)室保存，基因敲除所用供體菌JW0261-1、JW5775-2、JW3537-1購自美國耶魯大學(xué)大腸桿菌遺傳保藏中心（the Coli Genetic Stock Center, CGSC）。缺陷菌BW25113ptsG為實(shí)驗(yàn)室前期采用Red重組法構(gòu)建（所用引物為ptsG-knock-s、ptsG-knock-an，見表2，構(gòu)建方法參照文獻(xiàn)[16-17]）。質(zhì)粒pTrc99a為實(shí)驗(yàn)室保存，工具質(zhì)粒pKD4、pKD46、pCP20購自CGSC。

表1 本研究所用的菌株及質(zhì)粒

表2 本研究用到的引物

①Bold fonts indicate restriction enzyme sites.

② Italicized sequences indicate homologous sequences corresponding to respective gene target.

1.2 酶與試劑

Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為TaKaRa（大連）公司產(chǎn)品。異丙基--D-硫代半乳糖苷（isopropyl--D-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素鈉（Ampicillin）、硫酸卡那霉素（Kanamycin）、氯霉素（Chloramphenicol）購自Sigma公司。酵母提取物、胰蛋白胨為oxoid公司產(chǎn)品。其余試劑及試劑盒均為國產(chǎn)。引物由上海生工生物工程公司合成。

1.3 分子克隆主要方法

DNA酶切、連接、感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化、基因組提取等基本基因操作技術(shù)參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[18]及供應(yīng)商提供的操作手冊進(jìn)行。

1.3.1 主要質(zhì)粒構(gòu)建

本工作所用引物列于表2。參照GeneBank數(shù)據(jù)庫中已公布的.ATCC12633基因序列(GeneBankaccession no. AY143338.1)及.CB15基因序列(GeneBank Gene ID: 941308)，使用引物mdlc-s、mdlc-an擴(kuò)增基因插入pTrc99a的Ⅰ、HⅠ位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pTrM[圖1 (a)]。使用添加了核糖體結(jié)合位點(diǎn)TAATTTTGTTTAACTTT AAGTAAGGAGGATATATT的引物xdh-s和xdh-an擴(kuò)增基因插入pTrM的HⅠ、dⅢ位點(diǎn)，獲得重組質(zhì)粒pTMX[圖1 (b)]，測序驗(yàn)證。

1.3.2 基因缺失菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

參照文獻(xiàn)[19]，采用P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法敲除.MG1655基因。以插入卡那霉素抗性基因形成的基因缺陷型菌株作為供體菌、MG1655為受體菌進(jìn)行P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)，在加入卡那霉素的LB固體平板上篩選轉(zhuǎn)化子，以獲得目標(biāo)基因缺陷型菌株。采用以上方法，以JW5775-2（-）、JW0261-1（-）、JW3537-1（）、BW25113ptsG（-）等為供體菌，獲得相應(yīng)基因缺陷型的MG1655菌株。參考文獻(xiàn)[16-17]利用質(zhì)粒pCP20可以將菌株中攜帶的卡那霉素抗性基因去除，具體操作如下：將pCP20導(dǎo)入重組菌，30℃培養(yǎng)2 h，然后升溫至42℃培養(yǎng)12~16 h去除pCP20。使用以上方法，可以在菌株中進(jìn)行多個基因的敲除。本研究構(gòu)建的基因缺陷菌株見表1。基因缺陷菌株采用PCR驗(yàn)證，所用引物列于表2。

1.4 培養(yǎng)基與發(fā)酵條件

（1）種子培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法 種子培養(yǎng)采用液體LB培養(yǎng)基（g·L-1）：酵母粉5，蛋白胨 10，NaCl 10。在此基礎(chǔ)上添加15～20 g·L-1瓊脂粉即得固體LB培養(yǎng)基。120℃滅菌20 min，冷卻后根據(jù)情況加入氨芐青霉素100 μg·ml-1和/或卡那霉素50 μg·ml-1。將保存好的菌種在室溫下解凍，在固體LB培養(yǎng)基平板上劃線活化培養(yǎng)2次。挑取單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速190 r·min-1培養(yǎng)16 h至OD600nm達(dá)到5～6，用于接種發(fā)酵培 養(yǎng)基。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基及搖瓶發(fā)酵條件 1.5倍濃度的液體LB培養(yǎng)基，120℃滅菌20 min。冷卻后取50 ml培養(yǎng)基加入250 ml三角瓶，并加入10 g·L-1CaCO3及相應(yīng)的抗生素。將培養(yǎng)好的種子以10%接種量轉(zhuǎn)接，于33℃、轉(zhuǎn)速190 r·min-1培養(yǎng)6 h后加入終濃度為20 g·L-1的D-木糖以及終濃度為0.8 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)，根據(jù)情況加入一定量的葡萄糖。除特殊注明，均采用以上發(fā)酵條件，以誘導(dǎo)時為發(fā)酵起始時間。所有發(fā)酵設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)。

1.5 檢測方法

細(xì)胞密度測定采用濁度法。取2 ml發(fā)酵樣品，12000 r·min-1離心2 min，棄上清液，用生理鹽水清洗菌體2次。將重懸菌液稀釋合適倍數(shù)，進(jìn)行濁度測定。測定條件：采用北京普析通用公司生產(chǎn)的UV-VI型紫外可見分光光度計，波長600 nm[20]。

D-木糖、葡萄糖、D-1,2,4-丁三醇等濃度測定采用高效液相色譜法。取1.5 ml菌液，室溫下12000 r·min-1離心2 min，取上清液，用孔徑為0.22 μm的無菌濾膜過濾。分析條件：采用島津LC-15C型HPLC，色譜柱為Hamilton HC-75H+（7.8 mm×305 mm，5 μm），流動相為5 mmol·L-1H2SO4，流速0.5 ml·min-1，檢測器為示差折光檢測器RID-10A，柱溫55℃，進(jìn)樣量20 μl，LC solution 15C工作站。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照計算各物質(zhì)的含量。D-木糖、葡萄糖、D-1,2,4-丁三醇保留時間分別約為13.8、13.0、19.3 min。數(shù)據(jù)測定后取平均值，本研究中誤差線代表3個平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 D-1,2,4-丁三醇合成途徑的設(shè)計與構(gòu)建

利用.MG1655中具有的D-木糖酸脫水酶和醇脫氫酶[21-24]，并表達(dá)來自.CB15的編碼D-木糖脫氫酶的基因和來自.ATCC12633的編碼2-酮酸脫羧酶的基因，可催化圖1所示的a、b、c、d這4步反應(yīng)，形成D-1,2,4-丁三醇合成途徑。用攜帶質(zhì)粒pTMX（圖1b）可表達(dá)基因的重組菌MG1655-1搖瓶發(fā)酵，但未能檢測到D-1,2,4-丁三醇的合成（圖2）。

圖1 重組質(zhì)粒及由D-木糖合成D-1,2,4-丁三醇和葡萄糖分解代謝途徑

圖2 分支途徑的阻斷對重組菌株合成D-1,2,4-丁三醇的影響

對大腸桿菌代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，研究認(rèn)為MG1655自身代謝系統(tǒng)消耗了底物木糖或中間代謝物用于細(xì)胞生長和其他代謝，從而影響了D-1,2,4-丁三醇的合成。重組菌株MG1655-1可通過兩條途徑使底物D-木糖經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化經(jīng)由丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)[21]（圖1）：一條是D-木糖在木糖異構(gòu)酶（）的作用下生成木酮糖，接著被磷酸化為5-磷酸-D-木酮糖酸，進(jìn)入磷酸戊糖途徑；另一條是中間代謝產(chǎn)物3-脫氧-D-甘油戊酮糖酸在醛縮酶（和）的作用下裂解成丙酮酸和羥乙醛，進(jìn)入TCA循環(huán)。這表明敲除、、這3個基因是避免底物及中間代謝物被其他途徑消耗的有效方法。

構(gòu)建不同的基因缺陷型菌株，導(dǎo)入質(zhì)粒pTMX，發(fā)酵48 h后，D-1,2,4-丁三醇生產(chǎn)情況如圖2所示。相比菌株MG1655-1，通過阻斷底物D-木糖和D-1,2,4-丁三醇合成途徑中間代謝物的分解提高了重組菌株合成D-1,2,4-丁三醇的能力。或單個基因缺失的工程菌并不能生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇；、均缺陷時工程菌開始生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇，但是產(chǎn)量僅為0.15 g·L-1；同時缺失、、等基因的工程菌可生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇0.65 g·L-1。

2.2?培養(yǎng)條件對重組菌株合成D-1,2,4-丁三醇的影響

考察了溫度、裝液量、pH等條件對MJ133k-1合成D-1,2,4-丁三醇的影響。控制種子轉(zhuǎn)接前培養(yǎng)溫度為37℃，轉(zhuǎn)接后的溫度對D-1,2,4-丁三醇合成的影響如圖3 (a)所示，在33℃下D-1,2,4-丁三醇產(chǎn)量最高，達(dá)到0.76 g·L-1。這個溫度與Niu等的研究一致[1,21]，可能是由于低溫降低表達(dá)速率，有利于蛋白正確折疊[25-28]。圖3 (b)表明裝液量對D-1,2,4-丁三醇合成影響不大，說明溶氧不是搖瓶中限制D-1,2,4-丁三醇合成的因素。在誘導(dǎo)時添加5 g·L-1葡萄糖，通過添加10 g·L-1碳酸鈣或10 g·L-1堿式碳酸鎂維持發(fā)酵過程中pH分別在5.8和8.3左右，考察不同pH對D-1,2,4-丁三醇合成的影響。由圖3 (c)可知，添加CaCO3控制發(fā)酵過程中pH在偏酸性條件下發(fā)酵36 h D-1,2,4-丁三醇產(chǎn)量最高，達(dá)到3.96 g·L-1。

圖3 培養(yǎng)條件對重組菌株MJ133k-1合成D-1,2,4-丁三醇的影響（誘導(dǎo)時額外添加5 g·L-1葡萄糖）

2.3 葡萄糖利用與D-1,2,4-丁三醇合成的關(guān)系

2.3.1 葡萄糖添加量對D-1,2,4-丁三醇合成的影響

在誘導(dǎo)時分別添加0、5、10、20 g·L-1葡萄糖，進(jìn)一步研究葡萄糖添加量對MJ133k-1合成 D-1,2,4-丁三醇的影響。由圖4 (a)可知，葡萄糖添加量小于10 g·L-1時，可以促進(jìn)D-1,2,4-丁三醇的合成。添加5 g·L-1時效果最好，D-1,2,4-丁三醇最高濃度達(dá)到3.96 g·L-1。繼續(xù)提高葡萄糖濃度，D-1,2,4-丁三醇合成減少，當(dāng)加入20 g·L-1葡萄糖時D-1,2,4-丁三醇合成完全停止。對底物D-木糖利用情況進(jìn)行分析[圖4 (b)]，葡萄糖濃度小于10 g·L-1時D-木糖利用增強(qiáng)，但在添加20 g·L-1葡萄糖時發(fā)酵過程中D-木糖的濃度幾乎沒有變化。添加5 g·L-1葡萄糖可以促進(jìn)底物的利用并提高D-1,2,4-丁三醇的產(chǎn)量，但葡萄糖添加量高于10 g·L-1時底物利用減少，D-1,2,4-丁三醇的產(chǎn)量也隨之降低。這可能是由于低濃度的葡萄糖為菌株生長和酶合成提供了碳源和能源，而因分解代謝物阻遏效應(yīng)（carbon catabolite repression，CCR）的存在，高濃度的葡萄糖使木糖利用受到抑制[29]，影響了重組菌株合成D-1,2,4-丁三醇的能力。

圖4 葡萄糖對D-1,2,4-丁三醇合成和D-木糖利用的影響

2.3.2 PTS系統(tǒng)改造對D-1,2,4-丁三醇合成的影響

通過敲除基因改造大腸桿菌PTS系統(tǒng)，可以降低葡萄糖的攝取速率，克服葡萄糖效應(yīng)，使菌株可以同時代謝木糖和葡萄糖，并能減少乙酸累積，促進(jìn)產(chǎn)物生成[30-32]。在MJ133k-1的基礎(chǔ)上構(gòu)建基因缺陷株MJ134k-1，在加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)的同時加入10 g·L-1葡萄糖、20 g·L-1D-木糖，考察PTS系統(tǒng)改造對D-1,2,4-丁三醇合成的影響。由圖5可知，PTS系統(tǒng)改造前，菌株受到葡萄糖效應(yīng)的影響，D-1,2,4-丁三醇合成效率較低。敲除以后，雖然葡萄糖利用速率減慢，但是該菌株可以同時利用兩種底物，保證了菌株的生長代謝，又可為D-1,2,4-丁三醇合成提供充足的前體，D-1,2,4-丁三醇的產(chǎn)量也由改造前的2.05 g·L-1提高到3.05 g·L-1。Yao等[33]對幾種碳源同時利用菌株全局調(diào)控因子的轉(zhuǎn)錄水平變化進(jìn)行了研究，表明敲除所獲得的碳源同時利用效應(yīng)是通過增加和轉(zhuǎn)錄水平達(dá)到的，而和轉(zhuǎn)錄水平的增加可能通過某種機(jī)制活化或促進(jìn)了木糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[34-35]，圖5表明木糖代謝途徑的刪除并不影響這種機(jī)制的 激活。

圖5 PTS系統(tǒng)改造對重組大腸桿菌生產(chǎn)D-1,2,4-丁三醇的影響