賈海洋，孫歡，孫翔英，馮旭東，李春,

?

大腸桿菌溫敏耐熱系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用

賈海洋1，孫歡1，孫翔英2，馮旭東1，李春1,2

（1北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物工程系，北京 100081；2石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院/兵團(tuán)綠色化工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003）

發(fā)酵過程中熱脅迫不僅影響微生物的生長(zhǎng)和生產(chǎn)，還因冷卻控溫增加了生產(chǎn)成本。通過人工設(shè)計(jì)合成的溫敏型RNA開關(guān)調(diào)控來源于騰沖嗜熱菌（MB4）的熱激蛋白DnaK的表達(dá)，該溫敏型耐熱系統(tǒng)顯著提高了大腸桿菌的耐熱性，同時(shí)還減少了大腸桿菌在37℃過表達(dá)熱激蛋白的代謝負(fù)荷。將該系統(tǒng)應(yīng)用于產(chǎn)賴氨酸大腸桿菌的高溫發(fā)酵，不僅強(qiáng)化了其在40℃下的生長(zhǎng)能力，而且顯著提高了其在高溫下的生產(chǎn)能力，賴氨酸產(chǎn)量比對(duì)照組提高了2.95倍。溫敏型耐熱系統(tǒng)的應(yīng)用為人工耐熱生物系統(tǒng)的構(gòu)建提供了新方法。

生物技術(shù)；合成生物學(xué)；發(fā)酵；耐熱性；RNA溫敏開關(guān)；熱激蛋白；賴氨酸

引 言

近年來，我國發(fā)酵產(chǎn)業(yè)顯示出強(qiáng)大的活力，尤其是在一些大宗生化產(chǎn)品的生產(chǎn)規(guī)模方面處于世界前列。然而，在發(fā)酵過程中，微生物會(huì)受到許多不利條件的限制，這些條件大多是由培養(yǎng)環(huán)境自身代謝或培養(yǎng)環(huán)境引起的[1]。以賴氨酸發(fā)酵為例，一方面賴氨酸生產(chǎn)屬于中溫發(fā)酵，發(fā)酵溫度一般控制在（37.0±0.5）℃。由于在發(fā)酵過程中微生物會(huì)因菌體生長(zhǎng)和代謝而釋放大量熱能，發(fā)酵液溫度會(huì)隨之升高，嚴(yán)重影響菌體生長(zhǎng)與目標(biāo)代謝物的產(chǎn)率。另一方面，生產(chǎn)賴氨酸的原料、糖蜜以及玉米漿，需要經(jīng)過同步糖化過程的處理（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）[2]。而糖化過程中的糖化酶的最適催化溫度為60℃，這個(gè)溫度遠(yuǎn)高于一般賴氨酸生產(chǎn)菌株的生長(zhǎng)溫度，因此糖化過程后，需要冷卻降溫，這也極大地增加了生產(chǎn)成本。如果能提高發(fā)酵菌株的耐熱性，將會(huì)為工業(yè)生產(chǎn)帶來大量?jī)?yōu)勢(shì)：（1）降低冷卻成本；（2）加速細(xì)胞代謝，提高細(xì)胞合成效率以及生產(chǎn)效率，縮短發(fā)酵周期；（3）加速傳質(zhì)，使揮發(fā)性產(chǎn)品易于分離提??；（4）降低染菌風(fēng)險(xiǎn)[3-4]。因此，對(duì)發(fā)酵菌株進(jìn)行耐熱改造對(duì)發(fā)酵行業(yè)的發(fā)展是至關(guān)重要的。

提高菌株的耐熱性有高溫馴化和分子改造等方法。但是傳統(tǒng)的高溫馴化及誘變方法周期長(zhǎng)、工作量大、耗費(fèi)人力物力，還可能會(huì)丟失部分優(yōu)良性狀，而工業(yè)微生物發(fā)酵需要在保證不改變菌種優(yōu)良性狀的基礎(chǔ)上快速高效地提高微生物的耐熱性。從分子層面上，國內(nèi)外已有報(bào)道通過改變大腸桿菌自身的轉(zhuǎn)錄因子[5]或者引入外源熱激蛋白可以有效提高菌株耐熱性[6-8]。雖然熱激蛋白可以賦予微生物耐熱性，但是過量表達(dá)熱激蛋白會(huì)造成微生物的代謝負(fù)擔(dān)，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與生產(chǎn)[9]。因此，需要構(gòu)建更加高效、可控的微生物人工耐熱系統(tǒng)。近年來，合成生物學(xué)蓬勃發(fā)展。其將工程原理應(yīng)用到生物學(xué)，旨在人工設(shè)計(jì)基因編碼的生物系統(tǒng)，增加生物的系統(tǒng)性、可預(yù)見性、魯棒性、可擴(kuò)展性以及高效性[10-13]。合成生物學(xué)為高效生物系統(tǒng)的構(gòu)建提供了高效強(qiáng)力的方法。

另外，微生物上萬年的自然進(jìn)化，給了人們足夠的啟發(fā)，供人們?nèi)W(xué)習(xí)模擬。在應(yīng)對(duì)環(huán)境溫度變化時(shí)，細(xì)菌可以利用復(fù)雜的策略來控制基因的表達(dá)[14]。許多編碼熱激蛋白和毒力因子的基因是由溫敏型非編碼RNA序列調(diào)控的，稱為RNA溫度計(jì)（RNA thermometers）[15]。RNA溫度計(jì)位于mRNA 5′非翻譯區(qū)，折疊形成二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，同時(shí)隱藏了核糖體結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)溫度較低時(shí)，RNA溫度計(jì)不打開，阻止核糖體與核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而阻止翻譯的進(jìn)行，當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，釋放核糖體結(jié)合位點(diǎn)，翻譯得以進(jìn)行。天然的RNA溫度計(jì)主要有兩類。ROSE型 RNA溫度計(jì)包括2～4個(gè)獨(dú)立的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，3′端與SD序列互補(bǔ)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)只有在低溫下保持穩(wěn)定。所以大部分ROSE型RNA溫度計(jì)在30℃下保持關(guān)閉，37℃處于未完全打開狀態(tài)，42℃完全打開[16-18]。FourU型RNA溫度計(jì)是由4個(gè)尿嘧啶和SD序列中的AGGA互補(bǔ)配對(duì)，通常包括兩個(gè)獨(dú)立的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)是熱穩(wěn)定型的，另一個(gè)是熱敏感型的，30℃時(shí)為低翻譯水平，但是在45℃時(shí)完全開啟[19]。顯然，RNA溫度計(jì)提供了一個(gè)很好的利用溫度來誘導(dǎo)或抑制蛋白表達(dá)的工具。但是，大多數(shù)天然的RNA溫度計(jì)相對(duì)復(fù)雜，且響應(yīng)溫度的范圍比較窄，難以滿足可控的調(diào)節(jié)熱激蛋白表達(dá)的目的。因此有必要設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單、更加方便的人工合成的RNA溫度計(jì)。

本文將利用合成生物學(xué)的方法，通過異源表達(dá)嗜熱微生物的耐熱基因來提高大腸桿菌的耐熱性。為了緩解在常溫下過量表達(dá)熱激蛋白對(duì)微生物帶來的負(fù)擔(dān)，通過借鑒RNA溫度計(jì)人工合成了響應(yīng)一定溫度的RNA溫敏開關(guān)，用來調(diào)控?zé)峒さ鞍椎谋磉_(dá)，即特定高溫下大量表達(dá)，而在低溫下表達(dá)保持較低的表達(dá)水平，使得構(gòu)建的微生物耐熱系統(tǒng)更加可控，從而緩解正常溫度下熱激蛋白的過表達(dá)給微生物帶來的負(fù)擔(dān)。同時(shí)，將由RNA溫敏開關(guān)和熱激蛋白構(gòu)建的耐熱系統(tǒng)應(yīng)用于賴氨酸高溫發(fā)酵，以提高微生物的生產(chǎn)效率。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

TOP10，BL21（DE3）和pET-28a(+) 質(zhì)粒購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。騰沖嗜熱菌基因組由中國科學(xué)院微生物研究所饋贈(zèng)。pSB1C3、pSB1A3和 pSB1K3質(zhì)粒來源于iGEM Distribute Kit。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司（北京合成部）合成。Pfu DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為TaKaRa（大連）公司產(chǎn)品。IPTG、卡那霉素、氯霉素和氨芐青霉素購自Sigma公司。大腸桿菌LB培養(yǎng)基成分為：蛋白胨 10 g·L-1，酵母粉 5 g·L-1，氯化鈉 10 g·L-1。

1.3 RNA溫敏開關(guān)的人工合成與標(biāo)準(zhǔn)元器件的構(gòu)建

人工合成的兩條寡聚核酸單鏈通過梯度退火的方式合成雙鏈DNA（體系：100 μl，100 pmol DNA；PCR程序：95℃變性3 min，每8 s降低0.1℃，最終降至25℃）。由于設(shè)計(jì)的RNA溫敏開關(guān)需要制作為標(biāo)準(zhǔn)元件（biobrick），因此RNA溫敏開關(guān)的序列兩端要加上制作標(biāo)準(zhǔn)元件的前綴（prefix，5′-GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA GA-3′）和后綴（suffix，5′-GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA-3′）。隨后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切（Ⅰ和Ⅰ），與pSB1C3載體連接轉(zhuǎn)化，菌落PCR篩選陽性菌落。篩選得到的陽性菌落提取的質(zhì)粒即為標(biāo)準(zhǔn)元件，可用于3A-assembly[19]。

1.4 RNA溫度的表征——蛋白質(zhì)電泳與熒光強(qiáng)度檢測(cè)

過夜培養(yǎng)含有紅色熒光蛋白基因的大腸桿菌種子液，按照1:100的比例接種于新鮮的100 ml液體LB培養(yǎng)基中，170 r·min-1，分別于33、37、40、43℃培養(yǎng)，12 h取樣。分別利用SDS-PAGE蛋白電泳定性初步分析各溫度下的蛋白表達(dá)情況。為了探究紅色熒光蛋白在各溫度下的作用，拓寬了檢測(cè)溫度，用流式細(xì)胞儀進(jìn)一步對(duì)30、33、37、40、43℃下熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析（emission: 607，excitation: 584）。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度時(shí)，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)計(jì)算生成實(shí)驗(yàn)組的峰圖以及熒光強(qiáng)度。

1.5 恒定高溫培養(yǎng)

過夜培養(yǎng)的種子液按1:100接種至300 ml新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600為1.0左右，菌液一式三份，分別置于40、43、46℃高溫培養(yǎng)，開始每隔4 h取一次樣，培養(yǎng)12 h后，每隔12 h取樣，共培養(yǎng)51 h，以O(shè)D600值和點(diǎn)滴平板法表征大腸桿菌耐熱性。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

1.6 高溫賴氨酸發(fā)酵

過夜培養(yǎng)的種子液按1:100接種至48孔板中，在Biolector（m2p-labs，1000 r·min-1）40℃下培養(yǎng)48 h。發(fā)酵過程中每隔2 h用5%氨水調(diào)節(jié)pH至7.0。發(fā)酵過程中，每6 h取樣，發(fā)酵液12000 r·min-1離心2 min，將上清液用水稀釋至小于100 mg·ml-1。用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)量賴氨酸濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 人工合成RNA溫敏開關(guān)的設(shè)計(jì)

借鑒天然RNA溫度計(jì)的結(jié)構(gòu)，人工合成RNA溫敏開關(guān)(RNA temperature sensitive switch，RNAT)的結(jié)構(gòu)主要由SD序列（5′-AAGGAG-3′）、ASD（anti-SD，反義SD序列）以及之間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成[圖 1 (a)]?？梢酝ㄟ^The mfold Web Server預(yù)測(cè)和計(jì)算RNA溫敏開關(guān)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及自由能。RNA溫敏開關(guān)自由能大小的調(diào)整可以通過改變莖環(huán)序列堿基匹配程度，G-C含量以及環(huán)狀結(jié)構(gòu)的大小來實(shí)現(xiàn)。為方便元件之間的組裝，人工設(shè)計(jì)的RNA溫敏開關(guān)需要設(shè)計(jì)成標(biāo)準(zhǔn)元件，但是在通過3A-assembly方法組裝基因時(shí)，相鄰兩個(gè)基因之間產(chǎn)生的間隔區(qū)存在互補(bǔ)序列。因此單純地模擬RNA溫敏開關(guān)的原有序列不能很好地預(yù)測(cè)RNA溫敏開關(guān)的打開溫度，所以在模擬和設(shè)計(jì)RNA溫敏開關(guān)的結(jié)構(gòu)和自由能時(shí)，需要在RNA溫敏開關(guān)的序列中包含3A-assembly組裝方法產(chǎn)生兩個(gè)間隔區(qū)。根據(jù)The mfold Web Server提供的計(jì)算方法，本研究成功設(shè)計(jì)并人工合成一個(gè)RNA溫敏開關(guān)。兩條寡聚合甘酸序列為RNAT-S-5′-CGAATTCTTCTAGA GCTCCTTAAAAAAAAAAAGTACTAAGGAGTACTAGTACTGCAGGA-3′，RNAT-AS-5′-TCCTGCAGT ACTAGTACTCCTTAGTACTTTTTTTTTTTAAG GAGCTCTAGAAGAATTCG-3′。轉(zhuǎn)錄后得到的RNA序列為：5′-UACUAGAGCUCCUUA AAAAAAAAA AGUACUAAGGAGUACUAG-3′。用The mfold Web Server模擬得到的結(jié)構(gòu)如圖1 (c)所示，其自由能為Initial Δ-13.10 kcal·mol-1。為了驗(yàn)證RNA溫敏開關(guān)功能，通過3A-assembly，將RNA溫敏開關(guān)標(biāo)準(zhǔn)元件和無SD序列的啟動(dòng)子J23119以及紅色熒光蛋白（RFP，E1010）通過3A-assembly在大腸桿菌中構(gòu)建了報(bào)告基因表達(dá)盒[圖1 (b)]，所得菌株（J23119- RNAT-E1010）可用于熒光檢測(cè)和蛋白質(zhì)電泳分析。

圖1 合成RNA溫敏開關(guān)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

2.2 人工合成RNA溫敏開關(guān)的表征

為檢測(cè)RNA溫敏開關(guān)的感應(yīng)溫度同時(shí)驗(yàn)證人工設(shè)計(jì)的RNA開關(guān)是否可以正常工作，利用SDS-PAGE（定性）以及流式細(xì)胞儀（定量）測(cè)試所構(gòu)建的菌株J23119-RNAT-E1010在不同溫度下紅色熒光蛋白的表達(dá)情況。首先，SDS-PAGE結(jié)果表明在不同溫度下，紅色熒光蛋白（27.6×103）在大腸桿菌體內(nèi)有不同程度的表達(dá)[圖 2 (a)]。然后利用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)紅色熒光蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示RNA溫敏開關(guān)調(diào)控的紅色熒光蛋白在≤ 37℃下有微量的本底表達(dá)，并且隨著溫度升高紅色熒光蛋白熒光強(qiáng)度也相應(yīng)地提高，說明RNA溫敏開關(guān)隨著溫度的升高，莖環(huán)結(jié)構(gòu)逐漸打開，對(duì)SD序列的阻遏逐漸減小，43℃的熒光強(qiáng)度是33℃的7.3倍[圖 2 (b)]。另外，流式細(xì)胞儀的原始數(shù)據(jù)顯示，隨著溫度的升高，越來越多的工程菌株在37～40℃之間從陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃訹圖 2 (c)]。以上結(jié)果顯示，人工設(shè)計(jì)的RNA開關(guān)可以對(duì)溫度的變化做出動(dòng)態(tài)響應(yīng)，以此來調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯過程。因此，該RNA溫敏開關(guān)可以用于后續(xù)溫敏系統(tǒng)的構(gòu)建。

圖2 RNAT功能性表征結(jié)果

2.3 溫敏耐熱系統(tǒng)的構(gòu)建與表征

已有研究表明引入騰沖嗜熱菌的耐熱基因可以有效提高大腸桿菌的耐熱性[7,20]。本研究將從騰沖嗜熱菌種成功擴(kuò)增到的熱激蛋白基因應(yīng)用于大腸桿菌耐熱性改造。DnaK是廣泛存在于生物體內(nèi)起分子伴侶功能的熱激蛋白，可以通過DanK-DnaJ系統(tǒng)幫助非天然構(gòu)象的蛋白和新生肽鏈正確折疊并維持其結(jié)構(gòu)和功能，從而幫助生物抵抗熱脅迫[21-22]。將擴(kuò)增得到的基因在大腸桿菌中表達(dá)，SDS-PAGE結(jié)果顯示，30℃條件下誘導(dǎo)，該熱激蛋白DnaK可以在大腸桿菌正常表達(dá)，并且全部以可溶形式存在（圖3）。DnaK為分子伴侶，也有利于其可溶性表達(dá)。為了驗(yàn)證DnaK是否可以提高大腸桿菌耐熱性，本文設(shè)計(jì)了恒定高溫（40、43和46℃）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。由圖可知在3個(gè)溫度下工程菌比對(duì)照均表現(xiàn)出良好的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。40℃時(shí)，工程菌顯示出較快的生長(zhǎng)速率，OD600值比對(duì)照組有大幅提升（2倍）。而且對(duì)照在15 h后開始下降，工程菌一直在緩慢升高直至平緩。當(dāng)溫度提升至43℃后，工程菌的生長(zhǎng)情況也優(yōu)于對(duì)照組（1.8倍）。整體來看，雖然隨著溫度的上升，菌株的生長(zhǎng)情況變差，且當(dāng)溫度升至46℃后，工程菌的OD600最大值只有2.9，但是其生長(zhǎng)狀況仍然優(yōu)于對(duì)照菌，是對(duì)照組的1.5倍。以上結(jié)果顯示，來自騰沖嗜熱菌的DnaK可以有效地提高大腸桿菌耐熱性。

圖3 SDS-PAGE分析熱激蛋白DnaK在30℃下的誘導(dǎo)表達(dá)情況

M—protein marker; lane 1—negative control (no inducer added); lane 2—whole cell; lane 3—cell lysis; lane 4— precipitation

圖4 耐熱工程菌BL21-DanK與對(duì)照的生長(zhǎng)曲線

將獲得的RNA溫敏開關(guān)與DnaK組裝，即獲得對(duì)溫度敏感的大腸桿菌耐熱系統(tǒng)。為驗(yàn)證RNA溫敏開關(guān)對(duì)蛋白表達(dá)的調(diào)控對(duì)微生物生長(zhǎng)的益處，本文驗(yàn)證了在正常溫度（37℃）下，過量表達(dá)DnaK以及由RNA溫敏開關(guān)調(diào)控表達(dá)這兩種情況對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響（圖 5），結(jié)果表明由RNA溫敏開關(guān)控制菌株的生長(zhǎng)情況優(yōu)于過量表達(dá)DnaK的菌株。由于DnaK（70×103）分子量較大，過量表達(dá)會(huì)對(duì)細(xì)胞造成負(fù)擔(dān)，用RNA溫敏開關(guān)對(duì)DnaK的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，緩解DnaK在正常溫度下的過表達(dá)給細(xì)胞帶來的負(fù)荷，從而使細(xì)胞生長(zhǎng)狀況更優(yōu)。

圖5 37℃下溫敏型耐熱系統(tǒng)對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的影響

2.4 溫敏耐熱系統(tǒng)在賴氨酸高溫發(fā)酵中的應(yīng)用

將構(gòu)建的溫敏耐熱系統(tǒng)應(yīng)用于賴氨酸高溫發(fā)酵。在40℃下發(fā)酵48 h，每6 h測(cè)量賴氨酸產(chǎn)量，所得結(jié)果如圖6所示。菌株DanK-Lys在40℃下的生長(zhǎng)能力（Biolector監(jiān)測(cè)的biomass作為生長(zhǎng)指標(biāo)）比對(duì)照有了顯著提高[圖6 (b)]，同時(shí)其賴氨酸產(chǎn)量也有大幅提高，是對(duì)照組的2.95倍，實(shí)驗(yàn)室最高產(chǎn)量為8.47 g·L-1，極大地提高了高溫下生產(chǎn)能力[圖6 (a)]。盡管產(chǎn)量還沒有達(dá)到目前37℃下的水平，但是本研究對(duì)于高溫賴氨酸發(fā)酵，邁出了堅(jiān)實(shí)的一步。

圖6 40℃下DnaK-Lys和對(duì)照的賴氨酸發(fā)酵

3 結(jié) 論

本研究人工設(shè)計(jì)了對(duì)溫度響應(yīng)的RNA溫敏開關(guān)，將熱激蛋白（DnaK）與RNA溫敏開關(guān)進(jìn)行理性組裝并與大腸桿菌集成，構(gòu)建了溫敏型耐熱系統(tǒng)，緩解了大腸桿菌在37℃時(shí)的生長(zhǎng)負(fù)荷，大幅度提高其耐熱性，并將溫敏型耐熱系統(tǒng)應(yīng)用于賴氨酸高溫發(fā)酵，其在40℃的生產(chǎn)能力有了顯著提高。主要結(jié)論如下。

（1）通過軟件模擬，人工設(shè)計(jì)合成了RNA溫敏開關(guān)，能響應(yīng)溫度變化，調(diào)控蛋白在特定溫度下的表達(dá)。RNA溫敏開關(guān)調(diào)控的紅色熒光蛋白表達(dá)隨溫度的升高其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

（2）源于嗜熱菌的熱激蛋白DnaK，可以在大腸桿菌體內(nèi)全部以可溶性形式表達(dá)，并且在40、43、46℃下大幅提高了大腸桿菌的耐熱性。

（3）通過溫度敏感的RNA溫敏開關(guān)，調(diào)控?zé)峒さ鞍譊naK的表達(dá)，構(gòu)建了溫敏型耐熱系統(tǒng)，緩解了在37℃下DnaK的過量表達(dá)對(duì)大腸桿菌的代謝負(fù)荷。將溫敏型耐熱系統(tǒng)應(yīng)用于賴氨酸高溫發(fā)酵，在40℃下，賴氨酸產(chǎn)量提高了2.95倍。溫敏型耐熱系統(tǒng)可以有效提高高溫生產(chǎn)能力。

References

[1] Walker Graeme M, van Dijck P. Physiological and molecular responses of yeasts to the environment//Yeasts in Food and Beverages [M]. Berlin: Springer, 2006: 111-152.

[2] Rivas B, Moldes A B, Domínguez J M, Parajó J C. Lactic acid production from corn cobs by simultaneous saccharification and fermentation: a mathematical interpretation [J]., 2004, 34 (7): 627-634.

[3] Abdel-Banat B M, Hoshida H, Ano A, Nonklang S, Akada R. High-temperature fermentation: how can processes for ethanol production at high temperatures become superior to the traditional process using mesophilic yeast [J]., 2010, 85 (4): 861-867.

[4] Zeikus J. Thermophilic bacteria: ecology, physiology and technology [J]., 1979, 1 (4): 243-252.

[5] Christ D, Chin J W. Engineeringheat-resistance by synthetic gene amplification [J]., 2008, 21 (2): 121-125.

[6] Liu Y, Zhang G, Sun H, Sun X, Jiang N, Rasool A, Lin Z, Li C. Enhanced pathway efficiency ofby introducing thermo-tolerant devices [J]., 2014, 170: 38-44.

[7] Luan G, Dong H, Zhang T, Lin Z, Zhang Y, Li Y, Cai Z. Engineering cellular robustness of microbes by introducing the GroESL chaperonins from extremophilic bacteria [J]., 2014, 178: 38-40.

[8] Ezemaduka A N, Yu J, Shi X, Zhang K, Yin C C, Fu X, Chang Z. A small heat shock protein enablesto grow at a lethal temperature of 50℃ conceivably by maintaining cell envelope integrity [J]., 2014,196 (11): 2004-2011.

[9] Shenhar Y, Rasouly A, Biran D, Eliora Z Ron. Adaptation ofto elevated temperatures involves a change in stability of heat shock gene transcripts [J]., 2009, 11 (12): 2989-2997.

[10] Wang Y H, Wei K Y, Smolke C D. Synthetic biology: advancing the design of diverse genetic systems [J]., 2013, 4: 69-102.

[11] Khalil A S, Collins J J. Synthetic biology: applications come of age [J]., 2010, 11 (5): 367-379.

[12] Benner S A, Sismour A M. Synthetic biology [J]., 2005, 6 (7): 533-543.

[13] Purnick P E, Weiss R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems [J]., 2009, 10 (6): 410-422.

[14] Smoot L M, Smoot J C, Graham M R, Somerville G A, Sturdevant D E, Migliaccio C A, Sylva G L, Musser J M. Global differential gene expression in response to growth temperature alteration in group A[J]., 2001, 98 (18): 10416-10421.

[15] Kortmann J, Narberhaus F. Bacterial RNA thermometers: molecular zippers and switches [J]., 2012, 10 (4): 255-265.

[16] Nocker A, Hausherr T, Balsiger S, Krstulovic N P, Hennecke H, Narberhaus F. A mRNA-based thermosensor controls expression of rhizobial heat shock genes [J]., 2001, 29 (23): 4800-4807.

[17] Waldminghaus T, Gaubig L C, Klinkert B, Narberhaus F. Thethermometer is comprised of stable and unstable structural elements [J]., 2009, 6 (4): 455-463.

[18] Chowdhury S, Ragaz C, Kreuger E, Narberhaus F. Temperature- controlled structural alterations of an RNA thermometer[J]., 2003, 278 (48): 47915-47921.

[19] Waldminghaus T, Heidrich N, Brantl S, Narberhaus F. FourU: a novel type of RNA thermometer in[J]., 2007, 65 (2): 413-424.

[20] Sun Xiangying (孫翔英), Liu Yueqin (劉月芹), Sun Huan (孫歡), Jia Haiyang (賈海洋), Dai Dazhang (戴大章), Li Chun (李春). Construction of heat resistance devices forand their application [J].(化工學(xué)報(bào)), 2014, 65 (8): 3128-3135.

[21] Langer T, Lu C, Echols H, Flanagan J, Hayer M K, Hartl F U. Successive action of DnaK, DnaJ and GroEL along the pathway of chaperone-mediated protein folding [J]., 1992, 356 (6371): 683-689.

[22] Schr?der H, Langer T, Hartl F, Bukau B. DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage [J]., 1993, 12 (11): 4137.

Construction and application of temperature sensitive thermotolerant system in

JIA Haiyang1, SUN Huan1, SUN Xiangying2, FENG Xudong1, LI Chun1,2

(1School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China;2Key Laboratory for Green Processing of Chemical Engineering of Xinjiang Bingtuan, School of Chemistry and Chemical Engineering, Shihezi University, Shihezi 832003, Xinjiang, China)

The heat stress produced in fermentation process can not only affect the growth and reproduction of microorganisms, but also increases production cost from cooling and temperature control. The improvement of strain thermotolerance is highly desire for fermentation industry, which could significantly go up productivity and reduce production cost. So in this study, an artificial design and synthesis RNA switch with temperature sensitivity is employed to regulate and control the heat shock protein Dnak fromMB4, which leads to the thermotolerance improvement of. This improvement not only alleviated the burden of overexpressing heat shock protein inat 37℃, but also enhanced its productivity at high temperature. The results of application test show that at 40℃ the output of lysine produced by.increases by 2.95 folds, when compared with control group. This success could be twilight for the development of new method to prepare thermotalerance microorganisms.

biotechnology; synthetic biology; fermentation; thermotolerance; temperature sensitive RNA switch; heat shock protein; lysine

2014-12-29.

supported by the National Basic Research Program of China (2011CBA00800), the National Natural Science Foundation of China (21376028) and the National Science Fund for Distinguished Youth Scholars of China (21425624).

Prof. LI Chun, lichun@bit.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20141929

Q 789

A

0438—1157（2015）07—2613—07

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011CBA00800）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21376028）；國家杰出青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21425624）。

2014-12-29收到初稿，2015-03-24收到修改稿。

聯(lián)系人：李春。第一作者：賈海洋（1988—），男，碩士研究生。