雍有，朱晶瑩，盧滇楠，戈鈞，劉錚

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有機(jī)相溫敏性脂肪酶催化劑的結(jié)構(gòu)和催化特性

雍有，朱晶瑩，盧滇楠，戈鈞，劉錚

（清華大學(xué)化學(xué)工程系，工業(yè)生物催化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100084）

采用不同鏈長PEO嵌段的Pluronic分子P123、P105、F127及F108，將其端羥基氧化為醛基，使其與脂肪酶CALB的氨基反應(yīng)形成納米結(jié)合物。TEM分析結(jié)果顯示CALB-Pluronic結(jié)合物在甲苯中呈現(xiàn)直徑為20～40 nm的納米顆粒。所形成的CALB-Pluronic結(jié)合物在4-甲基-2-戊酮中呈現(xiàn)溫度響應(yīng)性，降低溫度可使酶催化劑沉淀出來，結(jié)合物中的Pluronic高分子PEO嵌段越長，其最低臨界共溶溫度（LCST）越高。采用甲苯為溶劑、正丁醇及正己酸為底物，37℃下的催化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CALB-Pluronic納米結(jié)合物比天然CALB的表觀活性提高4～6倍，而反應(yīng)結(jié)束后可通過降溫回收酶催化劑，顯示出脂肪酶-Pluronic納米結(jié)合物在有機(jī)相酶催化中的良好應(yīng)用前景。

生物催化；酶；納米粒子；有機(jī)相酶催化；嵌段聚醚；溫敏性高分子；酶-高分子結(jié)合物

引 言

脂肪酶可以催化酯水解、酯交換、酯合成等多種反應(yīng)，研究用于有機(jī)相合成的具有良好酯化功能的脂肪酶催化劑對(duì)于酶催化合成精細(xì)化學(xué)品和手性化合物具有重要意義[1-3]。然而，脂肪酶在非極性有機(jī)溶劑如甲苯中的催化活性很低，致使反應(yīng)速率過慢而失去實(shí)用價(jià)值。這主要是由于：① 酶分子不溶于非極性有機(jī)溶劑，故而呈現(xiàn)為聚集體顆粒形態(tài)，這使得底物接觸酶活性中心的難度增大；② 酶分子在非極性溶劑中的結(jié)構(gòu)剛性增強(qiáng)，進(jìn)一步導(dǎo)致催化活性降低[4-7]。傳統(tǒng)的固定化方法是將酶固定于載體之上，這能夠提高酶在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性，然而因?yàn)閭髻|(zhì)速率的限制，酶在有機(jī)相中的催化活性仍然很低[8]。為提高酶在有機(jī)相中的催化活性，有學(xué)者提出了溶劑工程[9]、底物印跡[10]、納米生物催化[11]等方法。在納米生物催化方面，如納米硅顆粒[12]、納米花[13]、高分子納米凝膠[14]、高分子-酶結(jié)合物[15]等納米酶催化劑能夠顯著提升酶的各項(xiàng)性質(zhì)。

近期Zhu等[16]提出了一種將有機(jī)相溫敏性高分子Pluronic與酶分子偶聯(lián)形成納米結(jié)合物的方法，該方法可使酶催化劑很好地分散于甲苯等非極性有機(jī)溶劑中，便于底物接觸到酶活性位點(diǎn)，使得酶催化劑的有機(jī)相表觀活性提高1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。反應(yīng)結(jié)束則可以降低溫度，使得酶-Pluronic高分子結(jié)合物沉淀出來，通過離心加以回收。酶-Pluronic結(jié)合物經(jīng)歷反復(fù)的升溫和降溫處理，其表觀活性保持不變。酶-Pluronic結(jié)合物的上述優(yōu)點(diǎn)使其在有機(jī)相酶催化中具有很好的應(yīng)用前景。Zhang等[17]采用該種酶-Pluronic結(jié)合物在4-甲基-2-戊酮(MIBK)中催化合成了抗腫瘤藥物戊柔比星(Valrubicin)。相比天然酶，酶-Pluronic結(jié)合物的催化活性和對(duì)產(chǎn)物的選擇性都有大幅度的提高。

Pluronic是BASF公司生產(chǎn)的一類聚氧乙烯聚氧丙烯三嵌段共聚物，其分子式可表示為EO-PO-EO，調(diào)整其EO和PO的組成，所得到的聚合物便可具有不同的結(jié)構(gòu)及溫度響應(yīng)特性[18]，這為其應(yīng)用于構(gòu)筑不同類型的酶催化劑提供了豐富的可能[19-20]。本工作以南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）為樣品酶，采用不同PEO嵌段長度的Pluronic制備CALB-Pluronic納米結(jié)合物，研究PEO嵌段長度對(duì)結(jié)合物的結(jié)構(gòu)、表觀催化活性以及溫度響應(yīng)性的影響規(guī)律，為此類有機(jī)相溫敏性酶催化劑的設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

Pluronic P123、Pluronic F127、Pluronic F108、脂肪酶lipaseB（CALB）等購自Sigma-Aldrich，USA。Pluronic P105購自武漢新大地環(huán)保材料有限公司。戴斯-馬丁氧化劑購自Adamas, China。氰基硼氫化鈉、磷鎢酸鈉、4-氨基- 3-肼-5-巰基-1,2,6-三唑（Purpald）、高碘酸鈉、甲醛、甘氨酸等購自Alfa Aesar, USA。十二烷基磺酸鈉（SDS）、丙烯酰胺、亞甲基雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、次高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白等購自北京拜爾迪公司。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、二氯甲烷、乙醚、甲苯、四氫呋喃、四硼酸鈉等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自北京賽馳生物科技有限公司。所有試劑均直接使用。

1.2 分析方法

采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清白蛋白，用酶標(biāo)儀（Tecan Sunrise，Switzerland）測定560 nm吸光度。聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）使用北京君意東方電泳設(shè)備有限公司JY300C電源供應(yīng)器及JY-SCZ2+電泳槽。結(jié)合物分散在有機(jī)溶劑中的形貌通過透射電子顯微鏡（Hitachi，H-7650B，Japan）觀察。

采用TNBS法測定結(jié)合物的氨基修飾率。用100 mmol·L-1、pH 9.3的硼酸緩沖液配制濃度為0.01～0.1 mmol·L-1甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液及適宜濃度的待測蛋白或結(jié)合物溶液。分別取1 ml樣品加入3ml 5%TNBS溶液，30℃下避光處理2 h，測定各樣品在420 nm的吸光度值。通過對(duì)比反應(yīng)前后蛋白溶液的吸光度，可計(jì)算氨基修飾率。

1.3 CALB-Pluronic結(jié)合物的制備

將2 g Pluronic溶解到100 ml二氯甲烷中，加入戴斯-馬丁氧化劑（其物質(zhì)的量為Pluronic的5倍），室溫?cái)嚢?2 h，得到渾濁反應(yīng)液。過濾除去不溶物（為戴斯-馬丁氧化劑的還原產(chǎn)物），將濾液旋蒸到剩余適量黏稠液體。對(duì)于Pluronic P123，因其為液態(tài)及膏狀物質(zhì)，無法通過乙醚沉淀，旋蒸后剩余液體直接置于真空烘箱中干燥12 h得到端基修飾產(chǎn)物。對(duì)于其他系列Pluronic，加入100 ml冷乙醚，沉淀得到大量白色沉淀，于冰水浴中靜置1 h，過濾后再用冷乙醚洗滌沉淀，置于真空烘箱中干燥12 h備用。

用磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.0）分別配制CALB溶液和端醛基Pluronic溶液，再混合，控制混合溶液中CALB的濃度為2 mg·ml-1，醛基與蛋白氨基（以蛋白表面氨基數(shù)計(jì)算）的摩爾比為1.1:1，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h。加入Pluronic 質(zhì)量的10%的氰基硼氫化鈉（預(yù)溶解在少量水中再加入），繼續(xù)室溫?cái)嚢璺磻?yīng)12 h。反應(yīng)后的溶液在磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（10 mmol·L-1，pH 7.0）中透析24 h。由于Pluronic L121在水中溶解度較差，配制溶液時(shí)加入少量四氫呋喃幫助溶解。

1.4 CALB-Pluronic結(jié)合物的分析和表征

結(jié)合物在有機(jī)溶劑中的形貌通過透射電子顯微鏡（Hitachi，H-7650B，Japan）觀察。將結(jié)合物分散到甲苯中，蛋白濃度為1mg·ml-1。在碳膜上滴加10ml樣品，等待45 s使甲苯揮發(fā)，并用濾紙吸去多余的樣品。滴加濃度10 g·L-1[1% (w/v)]、pH 7.0 的磷鎢酸鈉水溶液，60 s后除去碳膜表面多余溶液，室溫干燥后置于透射電子顯微鏡上觀察。

1.5 脂肪酶及其結(jié)合物的酶活測定

脂肪酶及其結(jié)合物在水相中的水解酶活采用對(duì)硝基酚酯（對(duì)硝基苯酚乙酸酯，對(duì)硝基苯酚丁酸酯，對(duì)硝基苯酚辛酸酯，對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯）作為底物測定。首先配制含有12.5 g·L-1[1.25%(w/v)] Triton X-100 的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液 (50 mmol·L-1，pH 7.0)，在攪拌下緩慢加入溶解了對(duì)硝基酚酯的丙酮溶液，配制成0.5 mmol·L-1的底物溶液，終溶液中丙酮體積分?jǐn)?shù)為 5%。測酶活時(shí)，將50ml 0.05 mg·ml-1酶液加到950ml底物溶液中，混合3 s后，在紫外可見分光光度計(jì)（SHIMADZU UV 2450，Japan）上測定1 min內(nèi) 348 nm 處的吸光度值的動(dòng)態(tài)變化。

采用正己酸和正丁醇作為底物測定脂肪酶CALB及其結(jié)合物在甲苯中的酶活。配制5 ml底物的甲苯溶液，正己酸和正丁醇濃度均為0.1 mmol·L-1，在40℃、200 r·min-1搖床中平衡15 min，加入凍干天然酶粉或結(jié)合物（蛋白含量為0.5 mg），反應(yīng)15 min后加入10 ml乙醇/丙酮（體積比1:1）混合液終止反應(yīng)，用0.05 mol·L-1氫氧化鈉溶液滴定剩余正己酸的量，從而計(jì)算酶活。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 結(jié)合物的結(jié)構(gòu)分析及表征

采用1.3節(jié)所述的合成方法，首先對(duì)PluronicP123、P105、F127及F108進(jìn)行端醛基修飾，然后偶聯(lián)CALB,得到相應(yīng)的CALB-Pluronic結(jié)合物。親水親油性（HLB）由高分子的親水程度決定，HLB值越低則高分子疏水性越強(qiáng)。Pluronic P123、P105、F127及F108具有相近長度的疏水PPO嵌段和依次增長的親水PEO嵌段，其HLB值分別為8、15、22、27（表1）。

表1 Pluronic的化學(xué)組成和親水親油性Table 1 Chemical compositions and HLB values of Pluronics

使用還原性的SDS-PAGE表征結(jié)合物，天然酶條帶顯示為38×103（圖1），結(jié)合物在更高分子量處出現(xiàn)連續(xù)條帶。與Pluronic反應(yīng)后天然酶的條帶消失，由此可確定天然酶與Pluronic形成結(jié)合物。通過測定氨基修飾率可知結(jié)合物中每個(gè)CALB約與3～8個(gè)Pluronic分子相結(jié)合。

A—protein molecular weight marker; B—CALB; C—P123-CALB; D—P105-CALB; E—F127-CALB; F—F108-CALB

將上面所得結(jié)合物在40℃下分散于甲苯、4-甲基-2-戊酮（MIBK）等有機(jī)溶劑中。使用透射電鏡（TEM）表征PluronicP123-、P105-、F127-、F108-CALB結(jié)合物在甲苯中分散的形貌，結(jié)果如圖2所示，可以看出結(jié)合物在常溫下聚集成粒徑在20～40 nm之間的納米顆粒。

2.2 結(jié)合物的催化活性

采用2.5節(jié)所述的方法測定PluronicP123-、P105-、F127-及F108-CALB結(jié)合物和天然CALB在水相中的活性，結(jié)果如圖3所示。由圖可知，與天然CALB相比，PluronicP123-、P105-、F127-及F108-CALB結(jié)合物的活性分別為113.0%、147.0%、63.2%及95.4%。

由圖3的結(jié)果可以看出Pluronic分子的組成和結(jié)構(gòu)對(duì)于所得到的脂肪酶結(jié)合物的活性存在顯著的影響。在本研究所涉及的4種Pluronic高分子中，P105-CALB結(jié)合物的水相活性最高，而要探討其中的原因，則需進(jìn)一步通過分子模擬和結(jié)構(gòu)分析揭示偶聯(lián)高分子后對(duì)于底物攝取、產(chǎn)物傳遞以及酶活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的影響機(jī)制。偶聯(lián)P105使得表觀活性提高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出通過化學(xué)方法強(qiáng)化酶催化活性的可能性。

采用1.5節(jié)所述的方法測定了Pluronic-CALB結(jié)合物和天然CALB在甲苯中催化正丁醇和正己酸的酯化反應(yīng)的活性，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，Pluronic P123-、P105-、F127-、F108-CALB結(jié)合物在甲苯中的催化活性為天然CALB的596%、440%、429%以及580%，換言之，結(jié)合物在甲苯中的表觀活性比天然酶提高了4～6倍。究其原因，由圖2可知，上述Pluronic-CALB結(jié)合物在甲苯溶液中均能夠呈現(xiàn)為納米級(jí)的分散，這樣就有利于底物接觸到酶催化活性位點(diǎn)而發(fā)生反應(yīng)。反之，天然CALB因?yàn)椴蝗苡诩妆蕉尸F(xiàn)為肉眼可見的宏觀聚集體狀態(tài)，這對(duì)于其與底物的接觸和催化是不利的。同樣，這里不同結(jié)構(gòu)的Pluronic分子對(duì)于脂肪酶表觀催化活性的提升效果存在差異，疏水性越強(qiáng)的 Pluronic 分子越有利于酶催化劑在甲苯中的分散，所呈現(xiàn)的表觀活性就越高。界面活化效應(yīng)[21]是脂肪酶活性的影響因素之一，疏水微環(huán)境能夠提升脂肪酶活性。實(shí)驗(yàn)表明，更加疏水的Pluronic P123-、P105-CALB在水相和有機(jī)相中都具有更高的催化活性。但Pluronic的選擇還應(yīng)考慮其偶聯(lián)酶的收率和回收特性。

2.3 結(jié)合物在有機(jī)相中的溫敏性

將2.5 mg結(jié)合物凍干粉末溶解于1 ml 4-甲基- 2-戊酮中，轉(zhuǎn)移到比色皿中，在紫外可見分光光度計(jì)（SHIMADZU MutiSpec1501，Japan）上測定550 nm處的吸光度變化。通過恒溫水?。▽幉ㄌ旌銉x器廠，DC-2006）控制溫度改變，其溫度控制范圍為5～40℃，每個(gè)溫度點(diǎn)穩(wěn)定5 min后測定。研究表明，Pluronic F127-CALB結(jié)合物在甲苯及MIBK中表現(xiàn)出溫度響應(yīng)性，4℃下能夠從溶劑中析出使溶劑渾濁，并引起吸光度改變。將Pluronic P123-、P105-、F127-、F108-CALB結(jié)合物在40℃下分散于MIBK溶劑中，并于-4℃靜置存放，均可觀察到溶劑渾濁及吸光度改變。通過逐步降溫法測定Pluronic P123-、P105-、F127-、F108-CALB結(jié)合物在MIBK中溶液的吸光度，得到Pluronic F127及F108-CALB的臨界最低共溶溫度（LCST）分別為20、15℃。Pluronic P123-、P105-CALB在常溫下不發(fā)生沉淀，但在-4℃保溫24 h后會(huì)發(fā)生沉淀，表明其具有溫度響應(yīng)性，但其LCST有待準(zhǔn)確測定（圖5）。

■Pluronic P123-CALB; ●Pluronic P105-CALB;▲Pluronic F127-CALB; ▼Pluronic F108-CALB

綜合分析，Pluronic F127-脂肪酶結(jié)合物在有機(jī)相中的析出溫度最高，這有利于降溫回收結(jié)合物。結(jié)合物的溫度響應(yīng)特性主要由結(jié)合物的親疏水性決定，親水性強(qiáng)的結(jié)合物在有機(jī)相中對(duì)溫度變化更加敏感而更易析出，疏水性強(qiáng)的結(jié)合物在有機(jī)相中分散性好而難以析出。在選擇高分子來制備Pluronic- CALB結(jié)合物時(shí)，應(yīng)兼顧酶催化活性和溫度響應(yīng)特性兩個(gè)因素，以提高酶催化過程的綜合效益。

3 結(jié) 論

考察了高分子PEO嵌段長度對(duì)Pluronic–脂肪酶結(jié)合物催化活性及溫敏性的影響。結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明結(jié)合物在有機(jī)相中以20～40 nm的納米顆粒的形式存在；CALB-Pluronic結(jié)合物在有機(jī)相中的酶活較天然酶提高4～6倍，表觀活性與Pluronic中 PEO嵌段長度相關(guān)，PEO嵌段越短則在有機(jī)相中的分散性越好，催化活性高。溫敏性實(shí)驗(yàn)表明疏水性較強(qiáng)的結(jié)合物在有機(jī)相中溶解性能更好；親水性較強(qiáng)的結(jié)合物則具有更好的溫度響應(yīng)性，更易于通過降溫析出。上述結(jié)構(gòu)和催化特性的研究結(jié)果對(duì)于此類有機(jī)相溫敏性酶催化劑的設(shè)計(jì)及應(yīng)用具有有益的依據(jù)和參考。

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Structural and catalytic characteristics of temperature-responsive lipase catalyst in organic solvents

YONG You, ZHU Jingying, LU Diannan, GE Jun, LIU Zheng

（Key Laboratory for Industrial Biocatalysis, Ministry of Education, Department of Chemical Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China）

Pluronic polymers P123, P105, F127 and F108, which have different chain lengths of PEO block were modified to generate aldehyde terminals for the conjugation with surface amine groups of CALB. The resulted Pluronic-CALB conjugates were characterized by SDS-PAGE and transmission electron microscopy. It was showed that the conjugates were dispersed well in toluene and appeared as nanoparticles with diameters ranged from 20 nm to 40 nm. The conjugates can be dispersed in methyl isobutyl ketone (MIBK) with temperature- responsive properties. The conjugate with a longer chain length of PEO block appeared a higher low critical solution temperature (LCST). The apparent activity of the conjugates in toluene at 37℃ was increased by 4 to 6 folds compared to the native counterpart. The recovery of CALB conjugates can be accomplished by precipitation at low temperature, making this enzyme conjugate suitable for industrial enzymatic synthesis in organic media.

biocatalysis; enzyme; nanoparticles; enzymatic catalysis in organic media; block polyether; temperature-responsive polymer; enzyme-polymer conjugate

2015-01-16.

Prof. LIU Zheng, liuzheng@mail.tsinghua.edu.cn

supported by the National Natural Science Foundation of China (21036003, 21206082).

10.11949/j.issn.0438-1157.20150068

TQ 028.8

A

0438—1157（2015）07—2534—06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21036003, 21206082）。

2015-01-16收到初稿，2015-03-30收到修改稿。

聯(lián)系人：劉錚。第一作者：雍有（1993—），男，博士研究生。