李巖

（黑龍江省綏化市青岡縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江青岡151600）

H 6亞型鴨源流感病毒HA基因序列分析

李巖

（黑龍江省綏化市青岡縣畜牧獸醫(yī)局，黑龍江青岡151600）

為了研究H6亞型禽流感病毒的分子特征，本研究從鴨的咽喉拭子樣本中分離到一株禽流感病毒，通過血凝抑制試驗證實該分離株為H 6亞型流感病毒，命名為A/duck/Heilongjiang/QG1/2013(H 6)。對其血凝素基因進(jìn)行了克隆和序列分析，結(jié)果表明分離株與我國鴨源禽流感病毒A/duck/Guangxi/585/2005(H 6N 5)的同源性最高，達(dá)到97.8%。系統(tǒng)發(fā)育樹分析進(jìn)一步證實分離株與A/duck/Guangxi/585/2005(H 6N 5)的親緣關(guān)系最近，共同起源于臺灣分離株A/chicken/Taiwan/G23/87(H 6N 1)。本研究為H 6亞型禽流感的流行病學(xué)研究補(bǔ)充了新的數(shù)據(jù)。

鴨；禽流感病毒；H 6亞型；HA基因；序列分析

禽流感（Avina inf luenza,AI）是由正黏病毒科、流感病毒屬的A型禽流感病毒（Avina inf luenza virus,AIV）引起的禽類感染或疾病綜合征，廣泛流行于世界上許多國家和地區(qū)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。1994年，美國動物衛(wèi)生協(xié)會根據(jù)AIV致病性的不同將其分為高致病性、低致病性和無致病性三種，但習(xí)慣上將后兩者統(tǒng)稱為低致病性AIV。在所有的亞型組合中，只有部分H5和H7亞型屬于高致病性AIV，其他亞型皆表現(xiàn)為低致病力[1-2]。高致病性AIV嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)并已威脅到人類健康，引起普遍的關(guān)注。低致病性AIV可導(dǎo)致禽類出現(xiàn)輕度呼吸道癥狀、食欲不振、產(chǎn)蛋量下降，導(dǎo)致禽的零星死亡，給禽類養(yǎng)殖者造成的損失也相當(dāng)嚴(yán)重，但關(guān)于低致病性AIV除了H9N2亞型的報道較多外[3-4]，其他亞型報道的相對較少。本研究從健康鴨咽喉拭子分離到一株H6亞型AIV，并對其HA基因進(jìn)行了序列分析，報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料AMV Re v e r s e T r a n s c r i ptase、RNase Inhibitor、Ex Taq聚合酶、dNTPs等購自大連寶生物工程公司；AxyPrep體液病毒DNA/ RNA小量制備試劑盒、膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司。H6亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和新城疫病毒（Newcast le disease virus,NDV）由哈爾濱獸醫(yī)研究所國家動物流感參考實驗室提供；9～11日齡SPF雞胚由哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供。鴨咽喉拭子采自黑龍江省青岡縣某養(yǎng)殖戶的家鴨。

1.2 病毒的分離及H A亞型鑒定病料按常規(guī)方法處理，接種10日齡SPF雞胚尿囊腔，每胚0.2 mL，37℃孵化72 h后，收集雞胚尿囊液，測定血凝價。將具有血凝價的雞胚尿囊液先與NDV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）試驗，NDV HI試驗陰性的雞胚尿囊液再與流感病毒H6標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行HI試驗，具體操作程序與判斷標(biāo)準(zhǔn)按文獻(xiàn)進(jìn)行[5]。將鑒定過的病毒分裝，保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計根據(jù)流感數(shù)據(jù)庫中H 6亞型A I V基因序列設(shè)計HA基因特異性引物，引物由上海英俊生物公司合成。反轉(zhuǎn)錄引物序列Uni12：5’-AGCAAAAGCAGG-3’。HA基因特異性上游引物序列：HA6-up:5’-TTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG-3’，HA6-low:5’-ATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTTT-3’。

1.4 病毒提取、c D N A合成及H A基因的克隆取200 μL病毒尿囊液，按照AxyPrep體液病毒DNA/ RNA小量制備試劑盒說明書提取病毒和核酸。用AIV反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12按照AMV Reverse Transcriptase使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用HA基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，隨后用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后將PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后連接pMD-18T載體，并進(jìn)行鑒定，挑選陽性克隆[6]。

1.5 H A基因測序及序列分析挑選3個上述鑒定為陽性的克隆送往上海英俊生物公司，用pMD-18T載體測序引物進(jìn)行測序。用DNAStar程序中的Seqman軟件對測得的序列進(jìn)行拼接。從GenBank中下載H6亞型AIV參考毒株HA基因序列，用DNAStar程序中的MegAlign軟件進(jìn)行同源性比對；用MEGA5.0軟件中的鄰接法繪制HA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒的分離及鑒定病料接種雞胚后收集的尿囊液能夠凝集雞紅細(xì)胞，經(jīng)多次雞胚傳代后血凝價能夠達(dá)到210。NDV陽性血清不能夠?qū)υ撃蚰乙寒a(chǎn)生抑制作用，而H6亞型AIV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能夠產(chǎn)生很高的抑制作用，血凝抑制效價達(dá)到8log2。

圖1 HA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR p roduct of HA gene

2.2 HA基因的克隆用H 6亞型A I V HA基因特異性引物對尿囊液中提取的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，可見在1744 bp左右處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖1。

2.3 H A基因的序列分析將測序的H A基因序列經(jīng)DNAStar軟件包中的Seqman軟件校對拼接，獲得完整的HA基因全長序列，為1744 nt，開放閱讀框位于18～1718 nt之間，為1701 nt。登陸Genbank，經(jīng)Blast搜索比對，用DNAStar程序中的MegAlign軟件進(jìn)行同源性比對，發(fā)現(xiàn)分離株HA基因完整開放閱讀框序列及編碼的蛋白序列與Genbank中收錄H6N5亞型鴨源AIV A/duck/Guangxi/ 585/2005（H6N5）的HA基因核苷酸和氨基酸序列同源率最高，分別為97.8%和98.1%。根據(jù)流感病毒通用命名法則，將該分離株命名為A/duck/Heilongjiang/QG1/2013（H6）。在蛋白水平上，HA基因編碼566個氨基酸的蛋白，分離株HA蛋白裂解位點附近氨基酸殘基為-PQIETR↓GLF-，符合低致病性AIV的分子特征。NetNGlyc 1.0 Server N-糖基化預(yù)測軟件分析表明分離株的HA蛋白中含有5個潛在的糖基化位點，分別為位于27位的NST，39位的NVT，182位的NNT，306位的NKT，557位的NGS。

2.4 H A基因系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制本研究選擇G e nbank中收錄的國內(nèi)H6亞型AIV的HA基因核苷酸序列來繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。研究表明我國H6亞型AIV HA基因演化為五個分支，見圖2。本研究中分離株HA基因與A/duck/Guangxi/585/2005（H6N5）的HA基因親緣關(guān)系最近，共同起源于臺灣分離株A/chicken/ Taiwan/G23/87（H6N1）。

圖2 HA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree o f HA gene

3 討論

H6亞型禽流感病毒為低致病力流感病毒，雖然在自然界中普遍存在，但是一般不引起宿主產(chǎn)生臨床癥狀，因此一直沒有引起人們的重視。30多年全球鳥類禽流感流行病學(xué)監(jiān)測中，在北美地區(qū)、歐洲、伏爾加河、里海北部、西伯利亞、日本和我國臺灣都曾分離得到H6亞型AIV[7-8],而且H6亞型在北美地區(qū)及歐洲還是優(yōu)勢亞型。近年來，我國H6亞型AIV的分離報道也逐漸增多。2000～2005年間，Cheung等從廣東汕頭活禽市場的禽類中分離到414株H6N1和H6N2亞型AIV，表明H6亞型AIV在我國流行較為普遍[9]。值得關(guān)注的是我國學(xué)者在進(jìn)行人血清流行病學(xué)調(diào)查時也發(fā)現(xiàn)可以檢測到H6亞型AIV抗體[10]，表明H6亞型AIV可以感染人，具有向人群侵襲的趨勢。本研究結(jié)果表明分離到了一株AIV A/ duck/Hei longj iang/QG1/2013（H6），其HA基因來源于H6N5亞型AIV，分子生物學(xué)分析進(jìn)一步證明其是一株低致病性H6亞型AIV。

Chin等2002年在華南陸生禽類分離到AIV A/ teal/Hong Kong/W312/97（H6N1）的6個內(nèi)部基因與致人死亡流感病毒分離株A/Hong Kong/156/97（H5N1）高度同源[11]，這警示我們H6亞型禽流感病毒具有重要的公共衛(wèi)生意義。因此對H6亞型低致病性毒株引起的AI，也應(yīng)保持高度警惕。

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HA gene analysis of a H6 subtype avian influenza virus isolated from domestic duck

Li Yan

（Animal husbandry and veterinary bureau of Qinggang,Heilongj iang Suihua 151600）

To investigate the molecular characteristics of H6 subtype avian inf luenza virus,the isolation of virus f rom the throat swabs of ducks was conducted.A H6 subtype avian inf luenza virus A/duck/Hei longjiang/QG1/2013(H6)was isolated and identi fied by hemagglutination inhibition tests.The hemagglutinin gene was cloned and analyzed.The resul ts showed that the virus was closely related with AIV A/duck/Guangxi/585/2005(H6N5)with the highest homology of 97.8%.Phylogenetic t ree analysis further confirmed that the HA gene of the isolate derived f rom AIV A/chicken/Taiwan/ G23/87(H6N1)isolated f rom Taiwan.The research has added new data for the H6 subtype of avian inf luenza epidemiological studies.

Duck;Avian inf luenza virus;H6 subtype;HA gene;Sequence analysis

S852.65

B

1672-9692(2015)04-0005-04

2015-02-19

李巖（1974-），男，本科，高級獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣和動物疾病診療工作。