盧月霞等

摘要：采用苯胺藍(lán)脫色法和纖維素剛果紅培養(yǎng)基鑒別法，從所采樣品中分離篩選到8株能較好降解木質(zhì)纖維素的菌株。對(duì)8個(gè)菌株的LiP酶、MnP酶、Lac酶、C1酶、Cx酶和纖維二糖酶（BG酶）分別進(jìn)行測(cè)定，得到4株酶類齊全且酶活較高的菌株H14、H17、W15、W23。在分析菌株相容性基礎(chǔ)上進(jìn)行菌株組合，對(duì)菌群的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，，在優(yōu)化條件下的LiP酶活性可達(dá)28.02 U/mL，Cx酶活性達(dá)38.16 U/mL，對(duì)玉米秸稈粉末的降解率高達(dá)35.24%。該菌群具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

關(guān)鍵詞：木質(zhì)纖維素降解；混合菌群；秸稈；降解效果

中圖分類號(hào)：X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）18-4464-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.019

中國(guó)擁有數(shù)量龐大的秸稈資源，由于秸稈結(jié)構(gòu)不均一，且各部分的化學(xué)成分非常復(fù)雜，使得秸稈在短時(shí)間內(nèi)不容易被降解。很多秸稈在田間被直接燒掉，破壞了生態(tài)平衡，使土壤肥力衰竭，造成農(nóng)業(yè)上的惡性循環(huán)，而且污染環(huán)境。利用適合常溫、組分失衡的微生物，構(gòu)建具有高效木質(zhì)纖維素降解功能的混合菌群，使秸稈資源能被快速充分的利用，對(duì)于促進(jìn)秸稈資源的有效利用、解決環(huán)境污染、保持經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展具有重大現(xiàn)實(shí)意義。為獲得高效降解木質(zhì)纖維素的混合菌群，以解決秸稈類固廢污染和秸稈資源的有效利用，本試驗(yàn)進(jìn)行了木質(zhì)纖維素降解菌群的篩選組配及其降解效果研究。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)分離所需樣品來自富含枯枝落葉的土壤和養(yǎng)殖場(chǎng)畜禽糞便。

初篩培養(yǎng)基、剛果紅鑒別培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備方法均參照文獻(xiàn)[1]。

木質(zhì)素酶檢測(cè)培養(yǎng)基（BM-Azure B 培養(yǎng)基）的成分為：酵母粉0.1 g/L， 葡萄糖2 g/L， Azure B 0.1 g/L， 瓊脂18 g/L， pH 6.5～7.0。

1.2 方法

木質(zhì)纖維素降解菌的初篩方法參照文獻(xiàn)[2]。

1.2.1 木質(zhì)纖維素酶活定性檢測(cè) 初篩得到的菌株分別用滅菌牙簽點(diǎn)接到鑒別培養(yǎng)基和苯胺藍(lán)脫色培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)48 h，選擇菌落周圍產(chǎn)透明圈和脫色圈的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵測(cè)定酶活。

1.2.2 木質(zhì)纖維素酶活定量測(cè)定 將篩選菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃，160 r/min搖床振蕩培養(yǎng)1～2 d， 3 500 r/min離心10 min，收集上清液對(duì)菌株的各類酶活進(jìn)行定量測(cè)定。纖維素酶包括三類酶，分別為Cx、C1和BG，其測(cè)定過程參照文獻(xiàn)[3，4]進(jìn)行；木質(zhì)素降解酶主要包括三類：Lip、MnP和Lacase，3種酶活測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.3 菌株相容性分析及菌群構(gòu)建 將各酶活較高的菌株兩兩混合，點(diǎn)種于初篩培養(yǎng)基平板上，定期觀察菌株的生長(zhǎng)情況，分析菌株之間的相容性，合理構(gòu)建混合菌群。將相容性強(qiáng)的菌株經(jīng)過夜培養(yǎng)后的菌懸液以體積比1∶1混合，將混合菌液接種到天然纖維素培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)一周，定期測(cè)定各酶活，并測(cè)定秸稈類物質(zhì)的降解率。

1.2.4 菌群產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究 將優(yōu)化組合接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基上，研究溫度、碳源、氮源、接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響，優(yōu)化菌群發(fā)酵條件。

1.2.5 菌群對(duì)秸稈類木素纖維素物質(zhì)的降解率測(cè)定 根據(jù)降解前后底物干重的變化計(jì)算降解率。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)纖維素降解菌的分離純化與篩選

參照文獻(xiàn)[2]中所述方法分離純化出78個(gè)菌株，按照1.2.2的方法檢測(cè)出具有酶活性的菌株32株，其中8株菌的透明圈和脫色圈比較明顯，它們?cè)趧偣t培養(yǎng)基平板和苯胺蘭脫色平板上透明圈和脫色圈直徑見表1，透明圈和脫色圈篩選法雖然直接快速，但僅以透明圈和脫色圈直徑大小作為菌株木質(zhì)纖維素酶活力大小的惟一指標(biāo)并不可靠，為此需對(duì)各菌株酶系特點(diǎn)進(jìn)行分析。

2.2 各菌株酶系特點(diǎn)

木質(zhì)素和纖維素的降解需要多種酶共同作用，木質(zhì)素降解酶系主要包括木質(zhì)素過氧化物酶（LiP）、錳過氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase），這些酶可在木質(zhì)素聚合物內(nèi)形成自由基，導(dǎo)致鍵的不穩(wěn)定從而打斷木質(zhì)素大分子，LiP被認(rèn)為是在木質(zhì)素類物質(zhì)降解過程中起關(guān)鍵作用的酶。纖維素降解必須依靠外切型葡聚糖酶（C1）、內(nèi)切型葡聚糖酶（Cx）、纖維二糖酶（BG）3種酶協(xié)同作用才能完成，因此需要全面系統(tǒng)分析菌株各種木質(zhì)素和纖維素酶的活性。分別對(duì)8個(gè)菌株的6類酶進(jìn)行定量測(cè)定，最后得到4株酶類齊全且酶活性較高的菌株，H14、H17、W15、W23，H14和H17為細(xì)菌，W15和W23為真菌。4菌株各類酶活測(cè)定結(jié)果如圖1。由圖1可知，菌株W23的LiP和Cx酶活最高，分別達(dá)到10.24 U/ mL和19.33 U/mL，但該菌株其他酶活較低，菌株各類酶活高低不同是限制天然木質(zhì)纖維素徹底降解的重要因素。

2.3 菌株相容性分析

將4菌株兩兩混合點(diǎn)接于初篩培養(yǎng)基平板上，定期觀察菌株的生長(zhǎng)情況，具體生長(zhǎng)情況見表2，結(jié)果表明，各菌株可以共存，彼此之間無拮抗現(xiàn)象發(fā)生，菌落之間無覆蓋或限制現(xiàn)象，各菌株之間的相容性為菌株組合協(xié)同降解天然木質(zhì)纖維素提供了研究基礎(chǔ)。

2.4 菌群構(gòu)建及對(duì)天然木質(zhì)纖維素降解能力測(cè)定

將4菌株過夜培養(yǎng)后的菌懸液，以體積比1∶1∶1∶1混合，將混合菌液分別接種到玉米秸稈發(fā)酵液連續(xù)培養(yǎng)一周，定期測(cè)定發(fā)酵液各類酶活性，由圖2可知，各種酶活性均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，各類酶活性高峰時(shí)間集中在第2天和第3天，且Cx在三類纖維素酶中活性最高，LiP在木質(zhì)素三類酶中也表現(xiàn)最明顯，Cx最高酶活性可達(dá)25.69 U/mL，LiP最高酶活性達(dá)16.41 U/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單菌株各類酶活性。天然木質(zhì)纖維素的降解需要各類酶協(xié)同作用，在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)充分重視多種微生物之間的協(xié)同效應(yīng)。在本試驗(yàn)中，木質(zhì)纖維素降解的關(guān)鍵酶是Cx和LiP，為此選擇這兩種酶作為產(chǎn)酶條件優(yōu)化的測(cè)定指標(biāo)。

2.5 菌群產(chǎn)酶條件優(yōu)化

2.5.1 溫度對(duì)酶活性的影響 將混合菌液以2%的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于不同溫度下，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，取樣測(cè)定LiP和Cx的活性，由酶活性測(cè)定結(jié)果（圖3）可知，菌群在30 ℃時(shí)的酶活性最高，該溫度比較適合菌群的生長(zhǎng)，故此溫度下菌群的產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。曲線總體趨勢(shì)顯示初期酶活性隨溫度增高而增加，溫度超過30 ℃時(shí)，酶活性呈下降趨勢(shì)。

2.5.2 碳源對(duì)酶活性的影響 除去碳源的液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入不同碳源：木屑、玉米糠、稻米糠、麥麩和甘蔗渣，于30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h，測(cè)定各發(fā)酵液LiP和Cx的活性，如圖4所示，碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶能力有很大的影響，玉米糠可以明顯促進(jìn)LiP和Cx的產(chǎn)生，而甘蔗渣作為碳源酶活性相對(duì)較低，

2.5.3 氮源對(duì)產(chǎn)酶影響 以除去氮源后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入不同氮源即酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、（NH4）2HPO4、 NH4H2PO4和尿素，培養(yǎng)條件同上，酶活測(cè)定結(jié)果（圖5）表明酵母膏更有利于酶的產(chǎn)生，（NH4）2HPO4、 NH4H2PO4能夠緩沖發(fā)酵過程中pH的變化，促進(jìn)產(chǎn)酶的效果較好。

2.5.4 接種量對(duì)產(chǎn)酶的影響 將菌群以不同接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)72 h后測(cè)定各發(fā)酵液LiP和Cx的活性，接種量不同，酶活性相差較大，以4%的接種量接種酶活最高（圖6），接種量太低菌株適應(yīng)環(huán)境較慢，所以產(chǎn)酶能力相對(duì)較差。同時(shí)木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)和成分的復(fù)雜性也決定在接種量較大情況下更有利于酶的產(chǎn)生。

2.6 菌群對(duì)不同底物的降解率測(cè)定結(jié)果

液體培養(yǎng)基中分別以木屑、玉米稈粉、稻米糠、麥麩和甘蔗渣作為碳源，將菌群接種液體培養(yǎng)基，30 ℃，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)7 d后，測(cè)定菌群對(duì)木質(zhì)纖維素類底物的降解率，降解結(jié)果如圖7所示，在5種木質(zhì)纖維素物質(zhì)中，菌群對(duì)玉米稈粉的降解率最高，可達(dá)35.24%，其次是甘蔗渣、稻米糠和麥麩，降解率分別為28.12%、25.36%和20.14%，對(duì)木屑的降解率最低，只有19.15%，菌株降解率取決于底物結(jié)構(gòu)，所以玉米稈粉更適合作為發(fā)酵底物。

3 小結(jié)與討論

本研究構(gòu)建的混合菌群具有較高的LiP酶和Cx酶活性，且對(duì)木質(zhì)纖維素類物質(zhì)具有較高的降解率，顯示出其在未來木質(zhì)纖維素物質(zhì)降解轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用潛力。木質(zhì)纖維素的降解是真菌、細(xì)菌及相應(yīng)微生物群落共同作用的結(jié)果，利用微生物菌群降解木質(zhì)纖維素對(duì)實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素快速轉(zhuǎn)化和開發(fā)木質(zhì)纖維素廢棄物處理的新菌劑必然具有一定的理論指導(dǎo)和現(xiàn)實(shí)意義。木質(zhì)纖維素生物降解不僅依賴于微生物自身的降解能力，在很大程度上還取決于環(huán)境條件，培養(yǎng)溫度、碳源、氮源、接種量等都對(duì)菌株產(chǎn)酶能力有著較大的影響，因此，優(yōu)化菌群的產(chǎn)酶條件對(duì)提高降解效率、加快降解進(jìn)程尤為重要，這方面的工作有待于進(jìn)一步完善。

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