邢沖云，周琳，莊強(qiáng)，湯麗苑

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325015）

姜黃素通過上調(diào)SOCS表達(dá)抑制JAK2/STAT信號(hào)通路的機(jī)制

邢沖云，周琳，莊強(qiáng)，湯麗苑

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 血液科，浙江 溫州 325015）

目的：研究姜黃素在骨髓增殖性腫瘤（MPNs）中通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白1、3（SOCS1、SOCS3）表達(dá)抑制JAK2/STAT信號(hào)通路的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)HEL及32D細(xì)胞株，分別用40 μmol/L姜黃素處理24、48 h。通過Western blot法檢測(cè)JAK2/STAT信號(hào)通路及SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)水平；通過染色體免疫共沉淀法檢測(cè)組蛋白乙?；潭雀淖儯煌ㄟ^比色法檢測(cè)組蛋白去乙?；福℉DAC）活性。結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)表明姜黃素顯著抑制HEL及32D細(xì)胞JAK2/STAT信號(hào)通路。姜黃素能夠抑制HDAC活性，同時(shí)降低HDAC1、HDAC3和HDAC8表達(dá)。姜黃素通過抑制HDAC活性，進(jìn)而增強(qiáng)SOCS1、SOCS3啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭?，從而上調(diào)SOCS1、SOCS3 mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)論：姜黃素通過上調(diào)SOCS1、SOCS3表達(dá)水平抑制JAK2/STAT信號(hào)通路。作為一個(gè)相對(duì)無(wú)毒的天然小分子化合物，姜黃素聯(lián)合其他抑制JAK2/STAT信號(hào)通路的藥物可能有助于MPNs的臨床治療。

姜黃素；骨髓增殖性腫瘤； 組蛋白去乙?；?；細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白

細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白（suppressors of cytokine signaling，SOCS）1、3是重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白，通過抑制JAK2/STAT信號(hào)通路發(fā)揮抑制骨髓增殖性腫瘤（myeloprol i ferative neoplasms，MPNs）細(xì)胞增殖的作用［1］。SOCS1直接結(jié)合JAK2蛋白，而SOCS3通過結(jié)合細(xì)胞因子間接靶向結(jié)合JAK2蛋白，最終SOCS1、SOCS3蛋白通過E3泛素化途徑快速降解JAK2蛋白。已有研究證明，JAK2V617F突變［2］和MPL515突變［3］激活JAK2/STAT信號(hào)通路，此信號(hào)

的激活導(dǎo)致MPNs細(xì)胞異常增殖，并最終導(dǎo)致MPNs的發(fā)生。JAK2V617F突變使得SOCS3蛋白磷酸化，并且使之失去抑制JAK2/STAT信號(hào)通路的能力［4］。姜黃素（curcumin）是一種植物多酚，能夠抑制JAK2/ STAT信號(hào)通路，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。本研究探討姜黃素通過調(diào)節(jié)SOCS1、SOCS3表達(dá)抑制JAK/STAT信號(hào)通路的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 HEL及32D購(gòu)買自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)RPMI 1640 10%胎牛血清培養(yǎng)。32D細(xì)胞在培養(yǎng)過程中加入10 ng/mL的IL-3。

1.2 JAK2/STAT信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用Western blot法對(duì)HEL及32D細(xì)胞株SOCS1、SOCS3、JAK2蛋白、STAT5蛋白、磷酸化JAK2（p-JAK2）及磷酸化STAT5（p-STAT5）蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，并用Biolab凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。以上抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗均為美國(guó)CST公司產(chǎn)品。

1.3 總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 常規(guī)Trizol方法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)（Beckman）定量，-80 ℃凍存。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)體系25 μL，包括1 μL總RNA、5×RT緩沖液5 μL、2 mmoL/L dNTP 1 μL、RNasin 1 μL、Random primer 1 μL、MMLV 1 μL、H2O 15 μL。反應(yīng)條件：25 ℃ 10 min，42 ℃ 60 min，75 ℃10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 乙酰化程度的檢測(cè) 染色體免疫共沉淀法（采用Mil l ipore公司EZ ChIPTMChromatin Immunoprecipi tation Ki t）檢測(cè)乙?；潭茸兓?。1×107細(xì)胞體外用甲醛交聯(lián)后，SDS裂解液徹底裂解細(xì)胞。冰上超聲裂解DNA，提取上清液加入5.0 μg相應(yīng)抗體，4 ℃過夜。每個(gè)IP管吸取10 μL作為Input。Protein G樹脂吸附蛋白抗體混合物后，依次經(jīng)過洗脫去交聯(lián)。DNA純化后用標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR檢測(cè)，與Iuput比較后得出乙?；患潭茸兓?。所用特異性引物如下：SOCS1-C1-179F：GACTTGGTGCTCCGTGCT，-54R：CGGGAGAGACAAAGAGGTGA；SOCS1-C2-503F：GCG GCCGCGATGCCCCTGA，-375R：CCCGCCGCCTGCTGGCCA；SOCS3-C1-765F：AGGCTCCTTTGTGGACTTCA，-624R：CTTCCTACCTGGTCCCGAAT；SOCS3-C2-299F：CCACGCTG CGCCCTTGCA，-160R：CCGAGCGACTGGGGCACCCA。

1.5 酶活性測(cè)定 采用比色法（試劑盒購(gòu)自美國(guó)Upstate公司）檢測(cè)組蛋白去乙?；福╤istone deacet y l ases，HDAC）活性變化。提取10、20、40 μmol/L姜黃素處理24、48 h后HEL及32D細(xì)胞核蛋白，加入HDAC底物，37 ℃溫育1 h，加入激活劑后，測(cè)定405 nm吸光度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間均值比較采用Student's t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素通過上調(diào)SOCS1、SOCS3蛋白表達(dá)抑制JAK2/STAT信號(hào)通路 HEL細(xì)胞株因?yàn)閿y帶JAK2V617F突變，JAK2/STAT信號(hào)通路持續(xù)活化；小鼠前體細(xì)胞株32D細(xì)胞加IL-3處理后，JAK2/STAT信號(hào)通路亦持續(xù)活化。為闡明姜黃素是否能夠抑制JAK2/STAT信號(hào)通路，上述2種細(xì)胞在體外用40 μmol/L姜黃素處理24、48 h后，通過Western blot法檢測(cè)JAK2/ STAT5信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素不僅降低總的JAK2 和STAT5蛋白水平，而且下調(diào)p-JAK2和p-STAT5蛋白水平（見圖1A-B）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，40 μmol/L姜黃素顯著上調(diào)SOCS1、SOCS3蛋白（見圖1C-D）及mRNA（見圖1E-F）表達(dá)水平。

圖1 姜黃素通過上調(diào)SOCS1/3蛋白表達(dá)抑制JAK2/STAT信號(hào)通路

2.2 姜黃素抑制HDAC酶活性及HDAC1、HDAC3和HDAC8表達(dá)水平 HEL和32D細(xì)胞在體外用10、20、40 μmol/L姜黃素處理48 h后，檢測(cè)HDAC酶活性，發(fā)現(xiàn)姜黃素以劑量依賴方式抑制HEL和32D細(xì)胞HDAC酶活性（見圖2A）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素降低HDAC1、HDAC3及HDAC8蛋白表達(dá)水平，但是對(duì)HDAC2表達(dá)沒有影響（見圖2B-C）。

圖2 姜黃素抑制HDAC酶活性及HDAC1、HDAC3和HDAC8表達(dá)

2.3 姜黃素增強(qiáng)SOCS1、SOCS3啟動(dòng)子組蛋白乙?；潭?如圖3A所示：在SOCS1、SOCS3轉(zhuǎn)錄啟始位點(diǎn)前1 000 bp內(nèi)分別設(shè)計(jì)2對(duì)引物，通過染色體免疫共沉淀方法檢測(cè)姜黃素是否影響SOCS1/3啟動(dòng)子組蛋白乙?；磉_(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素明顯增強(qiáng)SOCS1、SOCS3啟動(dòng)子組蛋白H3及H4乙?；潭龋ㄒ妶D3B-C）。

3 討論

組蛋白及非組蛋白的乙酰基修飾在癌癥的發(fā)展中起重要作用。到目前為止，一共發(fā)現(xiàn)4組18種HDAC，其中研究最廣泛的是I類HDAC，包括HDAC1～3和HDAC8。HDAC1～3在各類癌細(xì)胞中高表達(dá)，并且促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制凋亡及分化［5］。在前列腺癌細(xì)胞中抑制HDAC1表達(dá)有助于抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。美國(guó)FDA已批準(zhǔn)HDAC抑制劑伏立諾他（vorinostat）治療難治性T細(xì)胞淋巴瘤［7］。雖然化學(xué)合成的HDAC抑制劑呈現(xiàn)出強(qiáng)大的抑制HDAC能力及良好的治療效果，但其嚴(yán)重的不良反應(yīng)限制了這些藥物的進(jìn)一步應(yīng)用［8-9］。因此，在天然植物來(lái)源的小分子化合物中尋找低毒或無(wú)毒的HDAC抑制劑顯得非常重要。

姜黃素是從姜黃屬植物根莖姜黃中提取的一種植物多酚，已廣泛用于食品色素、防腐劑及佐味劑中［10］。姜黃素具有多方面的藥理作用，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎［11］以及神經(jīng)保護(hù)作用［12］等。姜黃素通過作用多種信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子，抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥［13-14］。例如：姜黃素在霍奇金淋巴瘤中抑制持續(xù)活化的NF-κB和STAT3信號(hào)通路［14］；姜黃素抑制K562細(xì)胞中STAT3/5入核［15］；在小細(xì)胞肺癌中，姜黃素通過降低p-JAK2和p-STAT3的水平，抑制細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移、增殖、浸潤(rùn)和血管生成［16］；姜黃素通過溶血磷脂酸誘導(dǎo)的STAT3磷酸化和IL-6與IL-8的分泌，導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)受阻［17］；在T淋巴細(xì)胞白血病中，姜黃素降低磷酸化JAK3、STAT3和STAT5表達(dá)水平［18］。然而，姜黃素抑制JAK2/STAT信號(hào)通路的機(jī)制仍不明確。

圖3 姜黃素增強(qiáng)SOCS1、SOCS3啟動(dòng)子組蛋白乙酰化程度改變。

飲食和環(huán)境因素可以導(dǎo)致表觀遺傳學(xué)的改變，而異常的表觀遺傳學(xué)通過腫瘤抑制基因的失活參與腫瘤的發(fā)生。姜黃素和其他飲食成分可以逆轉(zhuǎn)表觀遺傳學(xué)的改變。在MPNs中，SOCS1和SOCS3表觀遺傳學(xué)的異常已有大量研究。Capel lo等［19］報(bào)道，SOCS3甲基化發(fā)生在MPNs（占41.1%）和移植后髓系白血病（占58.8%），并導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默，而SOCS1的甲基化只見于小部分的MPNs（占13.4%）和移植后髓系白血?。ㄕ?5%）。然而，F(xiàn)ourouclas等［20］指出，SOCS3甲基化只見于23%的特發(fā)性骨髓纖維化（idiopathic myelof ibrosis，IMF）患者中，未見于真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）和原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）患者。SOCS3甲基化在MPNs中的不一致性，可能由于在不同SOCS3啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化的缺失，或者由于不同的患者入選標(biāo)準(zhǔn)。但是，HDACs是否影響SOCS1、SOCS3的表達(dá)并未完全闡明。已有文獻(xiàn)［21］報(bào)道，TSA通過上調(diào)SOCS1、SOCS3表達(dá)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的JAK2/STAT信號(hào)通路。HDAC抑制劑伏立諾他在小鼠PV模型中升高SOCS1、SOCS3的表達(dá)水平［22］?？傊?，DNA甲基化和HDAC調(diào)節(jié)SOCS1、SOCS3表達(dá)水平。本結(jié)果顯示，姜黃素降低了HDAC的活性，減少了HDAC1、HDAC3及HDAC8表達(dá)水平，通過增加SOCS1、SOCS3啟動(dòng)子區(qū)域組氨酸乙?；蕉险{(diào)SOCS1、SOCS3的表達(dá)，因此，我們推斷，姜黃素通過抑制HDAC活性增加SOCS1、SOCS3表達(dá)。

姜黃素能阻斷Raj i細(xì)胞和髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞的HDAC活性［13，23］。在髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，姜黃素通過阻斷HDAC活性和降低HDAC4表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G2/M期細(xì)胞周期停滯［13］。而且，姜黃素聯(lián)合HDAC抑制劑呈現(xiàn)更強(qiáng)的抗腫瘤活性。在SkBr3和435eB乳腺癌細(xì)胞中，姜黃素聯(lián)合TSA產(chǎn)生了比單用任一個(gè)藥物更強(qiáng)的抗增殖和凋亡作用［24］。姜黃素在低于中毒濃度下，使腫瘤細(xì)胞對(duì)HDAC抑制劑伏立諾他和帕比司他（panobinostat）誘導(dǎo)的細(xì)胞抑制和凋亡更敏感［25］。因此，與其他藥物聯(lián)合，姜黃素有可能成為治療MPNs和白血病的藥物。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Cu rcum in inhibits JAK 2/STAT signaling th rough increasing the expression of SOCS in m yeloproliferative neop lasm s

XING Chongyun，ZHOU Lin，ZHUANG Qiang，TANG Liyuan. Department of Hematology，the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Ob jective：To investigate the mechanism of curcum in in inhibiting JAK2/STAT signaling through increasing the expression of SOCS1/3 in myeloproliferative neoplasms. M ethods：JAK2/STAT signaling and protein levels of SOCS1/3 were detected by Western blotting in HEL and 32D. Acetylation of histone in the regions of SOCS1/3 promoter was detected by immunoprecipitation assay. Furthermore，HDAC enzyme activity was detected by colorimetric HDAC activity assay kit. Resu lts：Curcumin inhibited JAK2/STAT signaling in HEL and 32D cells in vitro. Curcum in could inhibite HDAC enzyme activities and decreased the levels of HDAC1，3 and 8. Curcum in elevated the m RNA and protein levels of SOCS1/3 via triggering acetylation of histone in the regions of SOCS1/3 promoter. Conclusion：Taken together，our data uncover a regulatory mechanism of SOCS1/3 through inhibition of HDAC activity by curcum in.

curcum in； myeloproliferative neoplasm s； histone deacetylases； suppressors of cytokine signaling

R96

A DOI：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.004

2015-03-12

溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20130044）。

邢沖云（1978-），男，浙江奉化人，主治醫(yī)師，碩士。