張宇寧，楊訓(xùn)俊，沈飛霞，呂建新

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室，Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325015）

線粒體DNA 12026A/G多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性研究以及Meta分析

張宇寧1，楊訓(xùn)俊1，沈飛霞2，呂建新1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室，Attardi線粒體生物醫(yī)學(xué)研究院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，浙江 溫州 325015）

目的：探討線粒體DNA NADH脫氫酶4亞基（ND4）基因12026 A/G多態(tài)性與2型糖尿?。═2DM）的相關(guān)性。方法：通過對溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院就診的551例T2DM患者和757例對照者的線粒體DNA（mtDNA）進行PCR擴增以及Sanger測序，統(tǒng)計分析ND4基因12026 A/G多態(tài)性與疾病的關(guān)系。采用logistic回歸分析計算患病風(fēng)險比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）。同時通過搜索Pubmed、Embase、中國知網(wǎng)以及萬方數(shù)據(jù)庫，匯總已發(fā)表研究12026 A/G多態(tài)性與T2DM關(guān)系的文獻，提取數(shù)據(jù)，并利用Revman 4.2和STATA 10.0軟件對數(shù)據(jù)進行Meta分析。結(jié)果：551例中國浙江籍T2DM患者中mtDNA 12026G基因型占4.49%，757例非T2DM對照中mtDNA 12026G基因型占4.75%，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（OR=0.94，95%CI：0.57～1.57；P=0.82）。然而匯總相關(guān)文獻的Meta分析結(jié)果顯示，MtDNA 12026 A/G多態(tài)性與T2DM的發(fā)生存在相關(guān)性（OR=1.95；95%CI：1.14～3.33，P=0.01）。結(jié)論：mtDNA ND4基因12026G基因型是中國人群T2DM的風(fēng)險因素，與T2DM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但其在不同人群中存在差異。

糖尿病，2型；線粒體DNA多態(tài)性；ND4；Meta分析

2型糖尿病（type 2 diabetes mel l itus，T2DM）已經(jīng)成為世界性的健康問題，T2DM是一組與系統(tǒng)性胰島素抵抗有關(guān)的代謝性疾病，并且會增加心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險。越來越多的研究表明，在T2DM中，線粒體DNA的突變在胰島素抵抗和β細胞的功能異常中起著重要的作用［1］。

人類線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）為16 569 bp的裸露閉合環(huán)狀雙鏈分子，外環(huán)由于富含鳥嘌呤稱其為重鏈，內(nèi)環(huán)富含胞嘧啶稱其為輕鏈。2條鏈均是編碼鏈，共編碼37個基因，包含13個氧化磷酸化（oxidative phosphorylation，OXPHOS）呼吸鏈復(fù)合體必需的多肽，22個與這些蛋白質(zhì)合成相關(guān)的tRNA（t ransfer ribonucleic acid）基因，2個與這些基因翻譯相關(guān)的rRNA（ribosomal RNA）基因：12s rRNA和16s rRNA基因［2］。實際上，線粒體是代謝性轉(zhuǎn)化的重要節(jié)點，同時也是代謝性應(yīng)激相關(guān)的研究熱點，因此與代謝性相關(guān)的遺傳性疾病與線粒體功能異常有關(guān)［3］。在mtDNA tRNALeu基因上的A3243G突變導(dǎo)致β細胞功能的損傷，由此表明線粒體在T2DM的胰島素分泌中起著關(guān)鍵作用。同時，也有研究［4］報道稱，位于NADH脫氫酶1亞基（NADH-dehydrogenase subunit 1，ND1）基因上的G3316A以及T3394C的多態(tài)性均與T2DM的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，究其原因有研究［5］認為，作為復(fù)合物I亞單位之一的ND1基因與酶的功能存在相關(guān)性。

線粒體呼吸鏈復(fù)合物I的重要組成部分NADH脫氫酶4亞基（NADH-dehydrogenase subunit 4，ND4）由mtDNA編碼。在日本的糖尿病人群研究中發(fā)現(xiàn)mtDNA 12026A/G是ND4基因上最常見的多態(tài)性位點［6］。本研究通過對浙江籍551例T2DM患者和757例非T2DM對照的mtDNA ND4基因進行多態(tài)性分析，旨在探討浙江籍漢族人群中T2DM患者mtDNA ND4基因的多態(tài)性情況與T2DM發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性；同時，通過對Pubmed、Embase、中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)庫的檢索，利用Meta分析的方法分析mtDNA 12026A/G的多態(tài)性在全球不同人群以及中國漢族人群中對于T2DM發(fā)生發(fā)展的影響作用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 隨機選取自2009年2月至2013年5月間于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的551例T2DM，其中男293例，女258例，年齡40～92歲，平均（61.5±12.8）歲，T2DM診斷依據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準。757例非T2DM對照選自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院體檢中心，其中男362例，女395例，年齡35～95歲，平均（57.8±12.0）歲，樣本納入標(biāo)準依據(jù)體檢各項檢驗指標(biāo)均在醫(yī)學(xué)參考值范圍內(nèi)，且無糖耐量異常、糖尿病史及其并發(fā)癥、高血壓、高血脂等病變或甲狀腺疾病等其他內(nèi)分泌疾病。

1.2 研究方法 ①基因組DNA提?。翰杉送庵莒o脈血1.5 mL，注入含有EDTA-K2抗凝劑的真空采血管中，充分混勻，采用DNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Ext raction Kit Ver.4.0）提取外周血全基因組DNA。②PCR擴增ND4區(qū)域：使用線粒體全基因組序列擴增通用引物，上游引物5'TATCACTCTCCTACTTACAG3（'np11928-11948），下游引物5'AGAAG-GTTATAATTCCTACG3' （np12792-12772），反應(yīng)產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳初步鑒定其片段大小，試劑盒（TAKARA DNA Fragment Puri f ication Ki t Ver.2.0）純化產(chǎn)物，乙醇濃縮，送華大基因測序，利用CodonCode Al igner軟件分析測序結(jié)果。

1.3 Meta分析 利用關(guān)鍵詞“糖尿病”或“2型糖尿病”或“T2DM”結(jié)合“突變”或“多態(tài)性”以及“線粒體”，通過檢索Pubmed、Embase、萬方以及中國知網(wǎng)，根據(jù)以下原則納入文獻：①所做研究涉及mtDNA 12026位點多態(tài)性與T2DM之間的相關(guān)性；②所納入的研究必須為病例對照實驗；③研究中所報道的數(shù)據(jù)可用于風(fēng)險關(guān)系的計算。因此，通過檢索4個數(shù)據(jù)庫我們總共篩選出4 822篇文章，同時排除綜述、摘要、二次發(fā)表以及病例報道和體外實驗，共排除了4 597篇文章，在剩余的文章中，排除其他mtDNA突變或多態(tài)性以及家系研究，剩余16篇文章，通過仔細閱讀全文，排除了7篇沒有可用數(shù)據(jù)或者數(shù)據(jù)重復(fù)的文章，最終納入了9篇文章［6-14］。手動提取符合要求的文章數(shù)據(jù)，利用Revman 4.2和STATA 10.0軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 用SPSS 17.0軟件分析收集到的所有樣本的臨床資料，涉及到的計量資料比較采用t檢驗，結(jié)果以±s來表示；計數(shù)資料采用x2檢驗和Fisher精確概率法檢驗。Meta分析中，12026A/ G多態(tài)性對T2DM合并OR值的計算采用隨機影響模型（異質(zhì)性檢驗P＜0.05）。異質(zhì)性檢驗采用Q檢驗，發(fā)表偏移評估采用漏斗圖檢驗。Meta分析使用Revman 4.2軟件和STATA 10.0軟件。所有統(tǒng)計分析均是雙向并以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床相關(guān)生化檢測 551例T2DM患者以及757例非T2DM對照者均無血緣關(guān)系。T2DM組的空腹血糖水平為（9.12±4.85）mmol/L，對照組的空腹血糖水平為（5.26±1.10）mmol/L。T2DM組的體質(zhì)量指數(shù)（BMI）明顯高于對照組（24.38 vs 22.95，P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義。同時，T2DM組的血壓、甘油三酯（TG）以及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-c）也明顯高于對照組（P＜0.001），而高密度脂蛋白膽固醇（HDL-c）低于對照組（P＜0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（詳見表1）。

表1 研究人群臨床相關(guān)生化檢測結(jié)果（±s）

表1 研究人群臨床相關(guān)生化檢測結(jié)果（±s）

項目　　對照組（n=757）　T2DM（n=551）　P 00 BMI（kg/m2）　 22.95± 2.89　 24.38± 3.39?。?.001收縮壓（mmHg）　121.72±16.74　140.90±24.17?。?.001舒張壓（mmHg）　 77.06±10.39　 79.72±11.57?。?.001空腹血糖（mmol/L） 5.26± 1.10　 9.12± 4.85　＜0.001總膽固醇（mmol/L） 4.95± 1.01　 4.51± 1.29?。?.001 TG（mmol/L）　 1.29± 1.15　 1.62± 1.32　＜0.001 HDL-c（mmol/L）　 1.38± 0.33　 1.19± 0.45?。?.001 LDL-c（mmol/L）　 2.44± 0.51　 2.79± 1.00?。?.001

2.2 PCR擴增以及DNA測序分析結(jié)果 將DNA測序的結(jié)果與劍橋序列（rCRS：NC_012920）［15］比對，發(fā)現(xiàn)551例T2DM患者中，有27例為mtDNA 12026G基因型，所占比例為4.49%；757例非T2DM對照中，有36例樣本為mtDNA 12026 G基因型，所占比例為4.75%。統(tǒng)計分析顯示：mtDNA 12026A和mtDNA 12026G多態(tài)性在浙江籍漢族人群中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，經(jīng)logist ic回歸校正性別、年齡及BMI分析后發(fā)現(xiàn)，mtDNA 12026A/G多態(tài)性與T2DM的發(fā)生發(fā)展也無相關(guān)性（OR=0.94；95%CI：0.57～1.57，P=0.82）。進一步分析12026A基因型和12026G基因型T2DM患者的病程，兩者之間的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 Meta分析10例病例-對照研究相關(guān)數(shù)據(jù)

圖1 Meta分析文獻納入流程圖

2.3 系統(tǒng)回顧與Meta分析 為進一步驗證mtDNA 12026A/G多態(tài)性與T2DM的發(fā)生發(fā)展是否存在相關(guān)性，本研究通過檢索4個電子數(shù)據(jù)庫，總共檢索到4 822篇文獻，通過納入排除原則篩選文獻后，共有9篇文獻（其中T2DM共4 103例，非T2DM對照共2 926例）可納入Meta分析，篩選流程見圖1。提取數(shù)據(jù)后（詳見表2），通過異質(zhì)性分析，確定采用隨機影響模型，通過敏感性分析和發(fā)表偏移分析確定Meta分析穩(wěn)定性（發(fā)表偏移見圖4）。最后，通過軟件將數(shù)據(jù)進行合并分析（見圖2，包括本研究結(jié)果），合并OR值（12026A/G多態(tài)性對T2DM發(fā)病風(fēng)險增加比值）為OR=1.95，95%CI：1.14～3.33，P=0.010；同時，根據(jù)Meta分析所納入的文獻，分析12026A/G多態(tài)性在中國漢族人群中（排除本研究的結(jié)果，T2DM 有2 318例，對照有1 331例）對T2DM發(fā)生發(fā)展的影響，統(tǒng)計結(jié)果表明12026A/G多態(tài)性與中國人群T2DM發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性（OR=2.50，95%CI：1.25～4.99，P=0.010）（見圖3）。綜合Meta分析的結(jié)果表明該多態(tài)性位點與T2DM發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)性，進一步人群亞組分析表明該位點多態(tài)性與T2DM發(fā)生發(fā)展的關(guān)系主要集中表現(xiàn)在中國漢族人群中。

圖2 Meta分析隨機模型下分析線粒體A12026G多態(tài)性與T2DM發(fā)病風(fēng)險之間的相關(guān)性

圖3 Meta分析隨機模型下分析中國人群線粒體A12026G多態(tài)性與T2DM的風(fēng)險關(guān)系

圖4 對所檢索分析中提取的數(shù)據(jù)分析A12026G多態(tài)性的發(fā)表偏移情況

3 討論

T2DM是最重要的代謝性疾病之一，同時也成為世界性的健康問題。目前，導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的詳細機制并未完全明了。β細胞的功能異常以及損傷性的胰島素抵抗被認為是導(dǎo)致糖尿病的關(guān)鍵機制［16-17］。越來越多的證據(jù)表明，mtDNA諸多位點的突變和/或多態(tài)性，對T2DM發(fā)生發(fā)展起重要作用。

線粒體是細胞產(chǎn)生ATP的細胞器，通過過去幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，線粒體在諸多疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其中包括糖尿?。?8］。目前已報道的與糖尿病有關(guān)的mtDNA多態(tài)性位點超過20個，但是這些多態(tài)性位點與糖尿病發(fā)生的相關(guān)機制尚不清楚。

呼吸鏈復(fù)合物I是線粒體氧化呼吸鏈5個復(fù)合物中最大的一個，且位于NADH氧化呼吸鏈之首，其功能是將電子轉(zhuǎn)移至輔酶Q，并催化NADH氧化為NAD+。同時，2個電子的轉(zhuǎn)移偶聯(lián)到4個質(zhì)子從內(nèi)膜間隙的負矩陣轉(zhuǎn)位到正側(cè)［19-20］。ND4亞基對于復(fù)合物I中其他脫氫酶亞基的組裝非常重要［21］。ND4亞基功能的異常會影響復(fù)合物I膜臂結(jié)構(gòu)的組成［22］。由此可知，ND4是復(fù)合物I的一個重要組成部分。有研究報道認為該變異是T2DM發(fā)病的風(fēng)險因素之一［23-24］。1998年Tawata等［6］通過對日本人群的研究首次發(fā)現(xiàn)了mtDNA 12026 A/G多態(tài)性，并認為12026 A/G多態(tài)性是日本人群T2DM發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險因素。本研究的病例對照的研究結(jié)果并未表明12026 A/G多態(tài)性與T2DM的發(fā)生存在相關(guān)性，但是，通過數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)該位點多態(tài)性與糖尿病合并視網(wǎng)膜病變的發(fā)生存在一定相關(guān)性。

通過搜索關(guān)于ND4基因突變與視網(wǎng)膜相關(guān)的研究表明，位于ND4基因上的G11778A突變與Leber遺傳學(xué)視神經(jīng)病變（LHON）存在相關(guān)性，由于該突變位點會影響ND4基因的翻譯與表達，從而導(dǎo)致視覺功能的缺失，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的缺少，視神經(jīng)的退化［25］。2007年，Qi等［26］研究表明大鼠雙眼ND4基因突變所導(dǎo)致的核蛋白異位表達會使得大鼠出現(xiàn)視神經(jīng)的萎縮。由于位于12026位點的A→G堿基置換使得由其編碼的異亮氨酸被纈氨酸取代，從而導(dǎo)致ND4二級結(jié)構(gòu)的改變。我們猜想mtDNA 12026A/G多態(tài)性可能會導(dǎo)致與視網(wǎng)膜功能相關(guān)蛋白質(zhì)的表達異常，但是該結(jié)論是基于對現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析以及已經(jīng)發(fā)表的文獻結(jié)果Meta分析所得，mtDNA 12026G基因型增加或是降低糖尿病合并視網(wǎng)膜病變的發(fā)生有待功能研究來驗證。

針對9個病例-對照研究中的4 103例T2DM和2 936例非T2DM對照［6-14］，利用Meta分析mtDNA 12026A/G多態(tài)性與不同人群T2DM的相關(guān)性，結(jié)果表明mtDNA 12026A/G多態(tài)性是T2DM發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險因素。對中國人群的亞組分析進一步表明，mtDNA 12026A/G多態(tài)性也是中國人群T2DM發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險因素?？紤]到本研究的樣本量較小可能會導(dǎo)致研究的偏移，因此我們應(yīng)開展更大樣本量的流行病學(xué)調(diào)查；同時考慮到mtDNA多態(tài)性存在地區(qū)和人群的差異，以及多個多態(tài)性位點的協(xié)同作用，我們在后續(xù)的研究中會予以闡述；此外考慮到mtDNA A/G多態(tài)性在T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用可能還與T2DM患者所處的生活方式和環(huán)境有關(guān)，也有待于更深入的研究。

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（本文編輯：吳健敏）

The correlative research between m tDNA 12026A/G polymorphism in ND4 gene and T2DM risk：a casecontrol study and meta-analysis

ZHANG Yuning1，YANG Xunjun1，SHEN Feixia2，LYU Jianxin1. 1.Attardi Institute of Mitochondrial Biomedicine，Zhejiang Provincial Key Laboratory of Medical Genetics，School of Laboratory Medicine and Life Science，Wenzhou Medical University，Wenzhou，325035； 2.Department of Endocrinology，the First Affliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015

Ob jective：To investigate the role of mitochondrial DNA 12026A/G （M t12026） polymorphism in NADH-dehydrogenase subunit 4 （ND4） gene in T2DM. M ethods：In order to detect 12026A/G polymorphism in ND4 gene，we used PCR and Sanger sequencing among 551 diabetic patients and 757 controls who were enrolled from the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University. Logistic regression analysis was used to estimate odds ratios （OR） and 95% conf dence intervals （CI）. We searched through electronic database PubMed，Embase，China National Know ledge Infrastructure （CNKI） and Wanfang，a meta-analysis was employed based on the publications which described the association of the M t12026A/G polymorphism w ith T2DM to evaluate the association between T2DM susceptibility and m itochondrial polymorphism in 12026A/G. Resu lts：In our research，the genotype of m itochondrial DNA 12026G in 551 diabetic patients was 4.49% and 12026G genotype in 757 controls was 4.75%，no signif cant association between diabetic patients and the controls for 12026A/G polymorphism （OR=0.94，95%CI 0.57～1.57，P=0.82） in Zhejiang province was found. But meta-analysis suggested that m.12026A/G polymorphism was associated w ith increased risk of T2DM （OR=1.95； 95%CI 1.14～3.33，P=0.01）. Conclusion：The M t12026A/G polymorphism is associated with an increased risk of T2DM in Chinese Han population，but differences are existed among different populations.

diabetes mellitus，type 2； m itochondrial polymorphism； ND4； meta-analysis

R446.1

A DO I：10.3969/j.issn.2095-9400.2015.10.003

2015-07-07

國家自然科學(xué)基金資助項目（81071426）；浙江省自然科學(xué)基金重大專項（D2080910）。

張宇寧（1990-），女，江西贛州人，碩士生。

呂建新，教授，博士生導(dǎo)師，Emai l：jxl u313@163. com。