張紅征，杜凡，周佰林，文正偉，李煥斌，王玲，張琦

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 核醫(yī)學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，浙江杭州 310020；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015）

hNIS基因轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞裸鼠模型的建立及核素顯像

張紅征1，杜凡2，周佰林3，文正偉1，李煥斌1，王玲1，張琦1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 核醫(yī)學(xué)教研室，浙江 溫州 325035；2.浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，浙江杭州 310020；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 放射科，浙江 溫州 325015）

目的：觀察人鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體（hNIS）重組質(zhì)粒（pcDNA3.1+-hNIS）脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞（SW480）的裸鼠模型介導(dǎo)放射性核素顯像的可行性。方法：酶切鑒定pcDNA3.1+-hNIS，轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞并檢測(cè)hNIS基因及蛋白的表達(dá)，篩選穩(wěn)定表達(dá)hNIS的SW480細(xì)胞，建立腫瘤裸鼠模型并進(jìn)行放射性核素99mTcO4-顯像。

人鈉/碘轉(zhuǎn)運(yùn)體；131I；結(jié)腸腫瘤；裸鼠

近年來(lái)由于生活水平的提高以及飲食結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率持續(xù)上升。全世界男性患者惡性腫瘤中CRC發(fā)病率居第三，女性居第二［1］。CRC起病隱匿，早期通常沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)，癥狀明顯時(shí)大多已處于中晚期，其生物學(xué)特性復(fù)雜且惡性程度高，化療的多重耐藥性令其預(yù)后不理想，進(jìn)展期結(jié)腸癌的治療一直都不理想。因此CRC的早期診斷以及早期治療尤為重要。

hNIS作為一種腫瘤報(bào)告以及治療基因，通過(guò)載體介導(dǎo)的hNIS基因轉(zhuǎn)染低分化甲狀腺癌或非甲狀腺癌細(xì)胞，在顯像及放射性131I治療研究中都取得了良好的效果［2］。對(duì)于CRC的放射性核素顯像和治療研究尚不多見(jiàn)，因而我們?cè)O(shè)想結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)與放射性核素顯像技術(shù)，將hNIS基因轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞中，使原本不攝碘的SW480細(xì)胞獲得攝碘能力，然后利用核素顯像，達(dá)到早期檢測(cè)腫瘤的目的，進(jìn)而為放射性131I治療打好基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1材料 SW480細(xì)胞購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)；空白質(zhì)粒pcDNA3.1+以及pcDNA3.1+-hNIS由核醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；99mTcO4-購(gòu)于中國(guó)原子高科有限公司；裸鼠BALB/C-nu/nu品系（SPF級(jí)）由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供；hNIS蛋白一抗購(gòu)于Abcam公司；內(nèi)參一抗以及相關(guān)二抗購(gòu)于Cell Signaling公司；RT-PCR及Western blot相關(guān)試劑盒購(gòu)于碧云天生物公司。

1.2方法

1.2.1pcDNA3.1+-hNIS及pcDNA3.1+行BamH I/EcoR I酶切鑒定：按照酶切步驟配置反應(yīng)體系，37 ℃反應(yīng)2 h，取2 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1　酶切反應(yīng)體系

1.2.2pcDNA3.1+-hNIS脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞并篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞：1640培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2、雙抗0.5 mL，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)SW480細(xì)胞，將細(xì)胞調(diào)節(jié)濃度至1.5×107/mL；接種至6孔板，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后觀察到細(xì)胞80%～90%融合狀態(tài)時(shí)換1640無(wú)血清培養(yǎng)基同步化24 h。將細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、空白對(duì)照組，按照脂質(zhì)體法操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染并于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；6 h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后G418篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到穩(wěn)定表達(dá)hNIS基因的單克隆SW480細(xì)胞系。

1.2.3RT-PCR及Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞hNIS mRNA及蛋白的表達(dá)：按照試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定細(xì)胞總RNA在260 nm和280 nm處的光密度值并計(jì)算RNA的含量和純度。然后對(duì)總RNA進(jìn)行RT，然后PCR。hNIS上游引物序列：gactgatgtgttcc aggtcgt，下游引物序列：gggtcgcagtcagtgtagaac；β-actin上游引物序列：ccttcctgggcatggagtcct，下游引物序列：ggagcaatgatcttgatctt。完成后每孔加5 μL的目的和內(nèi)參DNA行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。計(jì)算相同體積、濃度的上樣提取液，100 ℃ 10 min變性后于10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上進(jìn)行電泳分離，300 mA濕轉(zhuǎn)70 min將蛋白樣品轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。PVDF膜置與5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h。5%脫脂牛奶1∶500比例稀釋hNIS一抗，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次10 min，5%脫脂牛奶1∶1 000比例稀釋hNIS二抗，室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。加入ECL反應(yīng)液，與暗室中X線(xiàn)底片曝光，以β-actin為內(nèi)參，按照上述方法操作。

1.2.4裸鼠移植瘤模型的建立：5～6周裸鼠在恒溫（25～27 ℃）、恒濕（25%～50%）和SPF條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，在觀察到裸鼠精神、飲食以及排便等狀況良好的情況下，隨機(jī)分成轉(zhuǎn)染組、空白質(zhì)粒對(duì)照組、空白對(duì)照組3組，每組10只。以75%酒精消毒裸鼠肩胛骨處皮膚，各組在同一部位用注射器抽取0.2 mL相應(yīng)單細(xì)胞懸浮液注射于皮下。接種腫瘤細(xì)胞后，每日觀察裸鼠精神、飲食及排便等一般狀況，每3 d稱(chēng)量體質(zhì)量1次。成瘤后觀察移植瘤生長(zhǎng)情況，注意腫瘤表面有無(wú)紅腫、破潰等。SW480細(xì)胞接種同時(shí)按照5 mg/L加優(yōu)甲樂(lè)至裸鼠飲水中封閉甲狀腺直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，減少甲狀腺攝取量并增加移植瘤攝取量。

1.2.5hNIS轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后介導(dǎo)的腫瘤核素顯像：3組裸鼠腫瘤接種4周測(cè)得皮下瘤塊直徑達(dá)到15 mm左右時(shí)，分別取3組成瘤裸鼠，并固定于泡沫板上，俯臥位，每只裸鼠腹腔注射溶于0.l mL 0.9%氯化鈉溶液的300 μCi99mTcO4-，注射10 min后用SPECT顯像，采用低能高分辨準(zhǔn)直器，采集總計(jì)數(shù)500 K。

2　結(jié)果

圖1　重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS BamH I/EcoR I酶切凝膠電泳

2.1pcDNA3.1+-hNIS及pcDNA3.1+BamH I/EcoR I酶切凝膠電泳結(jié)果 以Beyotime DNA Ladder為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，重組質(zhì)粒組結(jié)果顯示在7 000 bp左右有1條清晰條帶，在2 000 bp和5 500 bp左右有2條清晰的條帶，與理論計(jì)算結(jié)果相符合。見(jiàn)圖1。2.2 G418篩選轉(zhuǎn)染hNIS-SW480細(xì)胞結(jié)果 未做任何處理的野生SW480在經(jīng)過(guò)0～1 000 μg/mL不同濃度培養(yǎng)2周后，得出最高能夠存活的G418濃度為200 μg/mL，見(jiàn)圖2。取高一個(gè)濃度為篩選濃度即300 μg/mL，培養(yǎng)經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和空白質(zhì)粒的SW480細(xì)胞，可得表達(dá)hNIS基因的細(xì)胞系（hNIS-SW480）。通過(guò)有限稀釋法挑出單克隆，之后維持G418濃度為篩選濃度的一半即150 μg/mL培養(yǎng)，即為穩(wěn)定表達(dá)hNIS基因的SW480細(xì)胞系，見(jiàn)圖3。

圖3　有限稀釋法得到的穩(wěn)定表達(dá)hNIS基因的SW480細(xì)胞系（×100）

2.3pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞hNIS RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳 RT-PCR后行1.5%瓊脂糖凝膠電泳轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)擴(kuò)增的369 bp大小條帶，而空白質(zhì)粒對(duì)照組及空白對(duì)照組未檢測(cè)到hNIS mRNA的表達(dá)，見(jiàn)圖4。SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Western blot電泳顯示在轉(zhuǎn)染組可見(jiàn)69 kd大小條帶，而空白質(zhì)粒對(duì)照組及空白對(duì)照組未檢測(cè)到hNIS蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖5。

圖4　重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞hNIS RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.4hNIS轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞系后介導(dǎo)的腫瘤99mTc04-核素顯像 荷瘤裸鼠甲狀腺封閉2周后，腹腔內(nèi)注射300 μCi99mTc04-顯像劑，10 min后應(yīng)用SPECT顯像，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染組移植瘤明顯顯影，而空白質(zhì)粒對(duì)照組及空白對(duì)照組移植瘤未顯影，見(jiàn)圖6。

圖5　重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞hNIS Western blot凝膠電泳結(jié)果

圖6　種植腫瘤后裸鼠模型99mTc04-顯像結(jié)果

3　討論

CRC是人類(lèi)常見(jiàn)惡性腫瘤之一，其發(fā)生與很多因素都有關(guān)，比如遺傳、飲食習(xí)慣等［3］。CRC的發(fā)生是多個(gè)基因如原癌基因和抑癌基因協(xié)同作用的結(jié)果。CRC早期沒(méi)有特異性癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)已多屬于晚期，手術(shù)治療以及多種化療藥物的耐藥性和嚴(yán)重的不良反應(yīng)降低了療效，近年來(lái)病死率居高不下。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐步發(fā)展，基因替換或修復(fù)、基因增補(bǔ)、基因失活、免疫調(diào)節(jié)等逐漸應(yīng)用于腫瘤的治療。hNIS作為一種報(bào)告基因和腫瘤治療基因，借助于hNIS的靶向特異性，可為CRC的診療開(kāi)辟新途徑。

hNIS主要功能是將細(xì)胞外碘離子逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)入甲狀腺細(xì)胞中，是甲狀腺激素生物合成、核素顯像及放射性碘治療的基礎(chǔ)。如今，hNIS被廣泛應(yīng)用到基因診療的研究中，Smit等［4］將hNIS基因轉(zhuǎn)染入帶有hNIS缺陷的濾泡性甲狀腺癌細(xì)胞系FTC 133中，增強(qiáng)了其對(duì)131I的攝取能力。在SPECT顯像過(guò)程中，作為報(bào)告基因?qū)δ[瘤進(jìn)行定位［5］；同時(shí)作為一種腫瘤治療基因，在放射性治療研究中，通過(guò)載體介導(dǎo)的NIS基因轉(zhuǎn)染非甲狀腺癌細(xì)胞，然后采取131I治療，并都取得了可喜的進(jìn)展，如前列腺癌、肝癌以及乳腺癌［6-8］。本實(shí)驗(yàn)中pcDNA3.1+-hNIS BamH I/ EcoR I雙酶切凝膠電泳結(jié)果符合理論計(jì)算結(jié)果。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法［9］成功將鑒定好的hNIS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SW480細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后檢測(cè)到hNIS mRNA以及蛋白的表達(dá)，而空白質(zhì)粒對(duì)照組及空白對(duì)照組均未檢測(cè)到hNIS mRNA以及蛋白的表達(dá)。建立裸鼠模型后應(yīng)用SPECT進(jìn)行99mTcO4-全身顯像，可得到轉(zhuǎn)染組移植瘤處高攝取影像，而空白質(zhì)粒對(duì)照組及空白對(duì)照組腫瘤處均未見(jiàn)攝取濃聚灶，說(shuō)明移植瘤表達(dá)hNIS蛋白并且具有功能，這為結(jié)腸癌的早期診斷提供了一種新的影像學(xué)檢查方法［10］。Scholz等［11］將hNIS轉(zhuǎn)染到結(jié)腸癌HCT 116細(xì)胞中行放射性碘治療取得良好的效果，杜凡等［12］實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出131I對(duì)轉(zhuǎn)染hNIS 的SW480細(xì)胞具有顯著殺傷效果，這也為我們進(jìn)一步進(jìn)行131I顯像以及體內(nèi)放射性碘治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

盡管hNIS的研究已經(jīng)取得顯著成果，但如何進(jìn)一步增強(qiáng)hNIS的表達(dá)、調(diào)節(jié)hNIS胞膜靶向定位、提高h(yuǎn)NIS重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的效率、體內(nèi)轉(zhuǎn)染以及放射性核素治療效果等方面，還需要更深入的研究。

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（本文編輯：吳健敏）

The construction of SW480 cells nude model transfected by hNIS gene and radionuclide imaging

ZHANG Hongzheng1， DU Fan2， ZHOU Bailin3， WEN Zhengwei1， LI Huanbin1， WANG Ling1， ZHANG Qi1. 1.Department of Nuclear Medical， Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325035； 2.Depaertment of Nuclear Medical，SIR RUN RUN SHAW Hospital， Zhejiang University， Hangzhou， 310020； 3.Radiological Department， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Objective: To examine the feasibity of radionuclide imaging mediated by colon cancer cells （SW480） nude model transfected with a recombinant pcDNA3.1+-hNIS plasmid. Methods: pcDNA3.1+-hNIS was confirmed by restriction enzyme digestion， the hNIS gene and protein expression were detected after transfection， the SW480 cells of stably expressing hNIS were screened， the tumors nude mice model was established，then radioactive nuclide99mTcO4-imaging was obtained. Results: After SW480 cells was transfected with pcDNA3.1+-hNIS， the hNIS gene and prote in expression were successfully detected. Radionuclide imaging was successfully mediated by colon cancer cells nude model. Conclusion: The hNIS expression can be achieved in colon nude model by the recombinant plasmid pcDNA3.1+-hNIS， and make the radionuclide imaging and radionuclide therapy of colon cancer as possible.

human sodium/iodide symporter；131I； colonic neoplasms； nude mice

R817-3

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.006

2015-03-26

張紅征（1984-），男，山東濰坊人，助教，碩士。

張琦，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：wzzhangqi@126. com。

結(jié)果：pcDNA3.1+-hNIS轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后成功檢測(cè)到hNIS基因及蛋白的表達(dá)，結(jié)腸癌裸鼠模型成功介導(dǎo)放射性核素99mTcO4-顯像。結(jié)論：重組質(zhì)粒pcDNA3.1+-hNIS可以實(shí)現(xiàn)結(jié)腸癌裸鼠模型的hNIS表達(dá)，使放射性核素顯像和結(jié)腸癌放射性核素治療成為可能。