林飛燕，吳愛(ài)華，張培麗，蔣磊，李紹堂

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室；2.普外科）

HoxB8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移的影響

林飛燕1，吳愛(ài)華1，張培麗1，蔣磊1，李紹堂2

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325015，1.內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室；2.普外科）

目的：通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)HoxB8基因的慢病毒表達(dá)載體，研究HoxB8基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移的影響。方法：采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出人HoxB8基因全長(zhǎng)，通過(guò)限制性內(nèi)切酶EcoR I和SAC I I雙酶切，T4 DNA連接酶連接，克隆至慢病毒載體，構(gòu)建Lenti-HoxB8-GFP重組載體。重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR和酶切鑒定，測(cè)序驗(yàn)證序列正確。將重組載體質(zhì)粒以及3個(gè)輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人腎上皮細(xì)胞（293T）進(jìn)行慢病毒包裝，收集病毒顆粒。然后將病毒顆粒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO，并將RKO細(xì)胞分為轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染慢病毒重組質(zhì)粒Lenti-HoxB8-GFP）、對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒Lenti-GFP）和空白對(duì)照組。RT-PCR和Western blot法檢測(cè)病毒感染后HoxB8在細(xì)胞中的表達(dá)情況。MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和Transwell小孔試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HoxB8基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)遷移的影響。結(jié)果：經(jīng)鑒定顯示重組載體質(zhì)粒構(gòu)建成功，測(cè)序正確。293T細(xì)胞高效包裝Lenti-HoxB8-GFP慢病毒，攜帶HoxB8基因的慢病毒感染RKO細(xì)胞后可看到大量綠色熒光，RT-PCR和Western blot法檢測(cè)分別證實(shí)HoxB8基因和蛋白在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中呈高表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖和平板克隆形成能力高于空白組及對(duì)照組。Transwell小孔試驗(yàn)結(jié)果顯示HoxB8高表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。結(jié)論：成功構(gòu)建HoxB8慢病毒表達(dá)載體，過(guò)表達(dá)HoxB8能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成以及遷移。

HoxB8；慢病毒載體；結(jié)直腸腫瘤；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；蛋白質(zhì)印記法

Hox（Homeobox）基因是一種發(fā)育相關(guān)基因，其編碼的蛋白在胚胎發(fā)育過(guò)程中起到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)作用。最早發(fā)現(xiàn)其在黑腹果蠅的胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。HoxB8是Hox基因家族成員之一，位于17號(hào)染色體上［1］。近期的研究［2-3］發(fā)現(xiàn)HoxB8在結(jié)直腸癌細(xì)胞中異常表達(dá)，并且與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展以及化療效果相關(guān)。本研究通過(guò)構(gòu)建HoxB8慢病毒表達(dá)載體，建立HoxB8過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，并研究其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響。旨在探討HoxB8的表達(dá)與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為進(jìn)一步研究HoxB8對(duì)結(jié)直腸癌的靶向治療及調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1主要材料和試劑 慢病毒表達(dá)載體Lenti-GFP以及3個(gè)輔助質(zhì)粒pMD2.G、pMDL-G/P-RRE和pRSVREV為本實(shí)驗(yàn)室保存。Taq DNA高保真聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I、SAC I I、T4 DNA連接酶均購(gòu)自NEB公司；DNA凝膠回收試劑盒、DNA補(bǔ)平試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)公司。HoxB8抗體購(gòu)自abcam；TRIzol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBGreen熒光定量PCR試劑購(gòu)自Invitrogen公司?；瘜W(xué)發(fā)光底物Thermo Scientific Super-Signal West Femto購(gòu)自Thermo Fisher，人胚胎腎上皮細(xì)胞293T和人結(jié)直腸癌細(xì)胞RKO購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。

1.2方法

1.2.1慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定：用TRIzol法提取RKO細(xì)胞總RNA，酶標(biāo)儀上測(cè)定260 nm/280 nm吸光度值A(chǔ)，計(jì)算RNA濃度，選取A260/A280比值介于1.8～2.1之間者用于反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物為：HoxB8-F-EcoR I 5’-CGA ATT CGC CAC CAT GAG CTC TTA TTT CG TCA AC-3’；HoxB-RSAC I I 5’-CCG CGG CTA CTT CTT GTC GCC CTT CTG-3’。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min（95 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 1 min）30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收后，與慢病毒載體分別進(jìn)行EcoR I/SAC I I雙酶切；酶切片段回收、連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌。選取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定。PCR陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒雙酶切鑒定，并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.2.2慢病毒包裝：空載體Lenti-GFP、重組質(zhì)粒Lenti-HoxB8-GFP、包裝質(zhì)粒pMD2.G、pMDL-G/P-RRE 和pRSV-REV分別用去內(nèi)毒素大量質(zhì)粒抽提，測(cè)定濃度。用OptiMEM和PEI（1 μg/μL）包裝慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，質(zhì)粒的用量：pMD2.G 3.5 μg/ 10 cm、pMDL-G/P-RRE 6.5 μg/10 cm、pRSVPREV 3.5 μg/10 cm和Transfer Vector 12 μg/10 cm。48 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況，收集上清，25 000 r/min超速離心2 h后用PBS溶解濃縮病毒。逐孔稀釋滴度測(cè)定法和Real-timePCR法測(cè)定病毒滴度（TU/mL）。

1.2.3慢病毒感染RKO細(xì)胞：將Lenti-HoxB8-GFP和空載體Lenti-GFP慢病毒以MOI值為5分別感染RKO細(xì)胞，感染12 h后換不含病毒的完全培養(yǎng)基，48 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。

1.2.4Real-time PCR檢測(cè)RKO細(xì)胞中HoxB8的表達(dá)：將在顯微鏡下能夠觀察到穩(wěn)定綠色熒光蛋白的RKOGFP（感染Lenti-GFP的RKO細(xì)胞）、RKO-HoxB8（感染Lenti-HoxB8-GFP的RKO細(xì)胞）以及RKO細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，1周后分別收集細(xì)胞，加入TRIzol提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用SYBGreen染料，在ABI-7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。引物序列為HoxB8-F：5’-TAA GCG GCG AAT CGA GGT AT-3’；HOXB8-R：5’-TGT TTC TCC AGC TCC TCC TG-3’。

1.2.5Western blot法檢測(cè)RKO細(xì)胞中HoxB8的表達(dá)：收集能夠穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白的RKO-GFP、RKO-HoxB8以及RKO細(xì)胞，加入裂解液抽提蛋白。參照BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)樣品取20 μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移。5%脫脂牛奶封閉1.5 h后一抗（HoxB8抗體和內(nèi)參GAPDH抗體）4 ℃過(guò)夜孵育，次日用TBST（含0.1% Tween）洗膜后用二抗室溫雜交1 h，再次洗膜，ECL顯色，最后在凝膠成像系統(tǒng)上成像。

1.2.6MTT法檢測(cè)HoxB8對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響：胰蛋白酶消化細(xì)胞，血清終止，PBS洗一遍，計(jì)數(shù)。按3 000個(gè)/孔接種于96孔板中，用MTT法分別檢測(cè)接種后第1、第2、第3、第4和第5天的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

1.2.7平板細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)：用胰蛋白酶消化細(xì)胞，血清終止后重懸并計(jì)數(shù)，按照每孔1 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于六孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，2周后用結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞集落數(shù)量和大小的變化。

1.2.8Transwell小孔試驗(yàn)：用胰蛋白酶消化細(xì)胞血清終止后1×PBS清洗2遍，無(wú)血清的培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種在小室內(nèi)，小室下方加800 μL完全培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，24 h后，用4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，觀察細(xì)胞的穿透情況。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，HoxB8 mRNA表達(dá)的差異比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1重組表達(dá)載體的鑒定 以RKO細(xì)胞中HoxB8基因全長(zhǎng)為模板擴(kuò)增HoxB8序列，用1.5%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在740 bp左右可見(jiàn)特異條帶（見(jiàn)圖1A）。將HoxB8的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行EcoRI/SACI I雙酶切，同時(shí)慢病毒載體也進(jìn)行酶切，酶切后電泳鑒定（見(jiàn)圖1B），用T4 DNA連接酶連接，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行小量搖菌后做酶切鑒定（見(jiàn)圖1C-D）。酶切產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序正確，重組載體Lenti-HoxB8-GFP構(gòu)建成功。經(jīng)檢測(cè)病毒滴度約108TU/mL。

圖1　重組表達(dá)載體的鑒定

2.2慢病毒感染RKO細(xì)胞后HoxB8的表達(dá)

2.2.1慢病毒感染后熒光蛋白的表達(dá)：慢病毒感染結(jié)直腸癌細(xì)胞，用終濃度8 μg/mL的polybrene增強(qiáng)感染效果，72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，其綠色熒光蛋白表達(dá)量達(dá)到90%以上（見(jiàn)圖2）。

圖2　Lenti-GFP和Lenti-HoxB8-GFP感染后發(fā)綠色熒光的RKO細(xì)胞（×100）

2.2.2Real-time PCR和Western Blot法檢測(cè)HoxB8 mRNA及蛋白的表達(dá)：Real-time PCR結(jié)果顯示HoxB8過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中HoxB8 mRNA表達(dá)量明顯增高（見(jiàn)圖3A）。說(shuō)明Lenti-HoxB8-GFP慢病毒感染RKO細(xì)胞后能夠穩(wěn)定表達(dá)HoxB8 mRNA。Western Blot法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HoxB8過(guò)表達(dá)組細(xì)胞其HoxB8蛋白的表達(dá)量增加（見(jiàn)圖3B），說(shuō)明包裝產(chǎn)生的Lenti-HoxB8-GFP慢病毒感染RKO細(xì)胞后能夠穩(wěn)定表達(dá)HoxB8蛋白。

2.3HoxB8過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO生長(zhǎng)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖4。在細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)中，HoxB8過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的克隆數(shù)明顯多于其他2組，說(shuō)明HoxB8能夠增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力（見(jiàn)圖4A、C）。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，HoxB8過(guò)表達(dá)組細(xì)胞其生長(zhǎng)速率高于空白對(duì)照組（RKO細(xì)胞）和陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)入空載體Lenti-GFP的RKO細(xì)胞）（見(jiàn)圖4B）。

2.4HoxB8過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株RKO遷移的影響 RKO、RKO陰性對(duì)照和RKO轉(zhuǎn)染組細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行Transwell試驗(yàn)，結(jié)果顯示HoxB8過(guò)表達(dá)組有較多細(xì)胞穿透Tranwell小室，說(shuō)明HoxB8過(guò)表達(dá)能夠增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力（見(jiàn)圖5）。

3　討論

在人類基因組中存在39個(gè)Hox基因，分布在7p15、17p21、12q13和2q31等4條染色體上［4］。研究發(fā)現(xiàn)Hox基因與多種腫瘤的發(fā)展相關(guān)，例如結(jié)直腸癌、胸腺癌、前列腺癌、肺癌、惡性膠質(zhì)瘤、甲狀腺瘤、卵巢癌、膀胱癌、腎癌以及黑色素瘤等［5-7］。與胸腺癌（來(lái)自外胚層）相比，一些具有相似胚胎起源的腫瘤組織（來(lái)自內(nèi)胚層）例如結(jié)直腸癌、前列腺癌以及肺癌，表現(xiàn)出相似的HoxA和HoxB家族基因表達(dá)模式［8］。不同的Hox基因在組織中的不同位置差異性表達(dá)，例如與正常組織相比大腸癌左側(cè)有10種Hox基因的異常表達(dá)［5］。有研究表明Hox基因在腫瘤組織中異常表達(dá)，例如一些研究中發(fā)現(xiàn)融合蛋白介導(dǎo)的某些Hox基因的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［9］。此外HoxA9、HoxB8以及HoxB9在腫瘤中呈高表達(dá)，而HoxB2、HoxB13以及HoxD8等在腫瘤中呈低表達(dá)［5］。Vider等［3］通過(guò)細(xì)胞水平研究表明HoxB8在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。并且這種現(xiàn)象在結(jié)直腸癌發(fā)展的各個(gè)時(shí)期（包括癌變前期息肉）都有出現(xiàn)［10］。

Hox蛋白是胚胎發(fā)育過(guò)程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，且其家族中的不同組成部分在成熟組織中呈差異性表達(dá)。有研究表明在結(jié)直腸癌細(xì)胞系如CaCo-2和HT29中，HoxB6、HoxB8、HoxC8以及HoxC9表達(dá)上調(diào)，并且這種現(xiàn)象在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段都有出現(xiàn)［3］。Liao等［11］通過(guò)體內(nèi)體外研究表明HoxB7過(guò)表達(dá)與癌細(xì)胞增殖及結(jié)直腸癌形成有關(guān)。Hur等［12］研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌中HoxA6、HoxA13、HoxB2、HoxB4、HoxB5、HoxB6、HoxB7、HoxB8、HoxB9、HoxC5、HoxC9、HoxC13、HoxD1以及HoxD8出現(xiàn)異常表達(dá)。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比癌組織中有些Hox基因（例如HoxA1、HoxA2、HoxA3、HoxA5、HoxA9、HoxC11、HoxD3、HoxD4、HoxD8、HoxD9以及HoxD10）表達(dá)下調(diào)［13］，并且在乳腺癌細(xì)胞中HoxA5能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。此外Shaoqiang等［15］還發(fā)現(xiàn)HoxD3高表達(dá)的乳腺癌患者，其生存率明顯低于HoxD3低表達(dá)的患者，證明HoxD3與不良預(yù)后有關(guān)。前列腺癌細(xì)胞中HoxC8過(guò)表達(dá)能夠影響細(xì)胞的分化潛能，在腫瘤的遷移侵襲過(guò)程中發(fā)揮著一定的作用［16］。另有研究發(fā)現(xiàn)HoxA9、HoxA13、HoxB13、HoxD13以及HoxC11在前列腺的發(fā)育過(guò)程中起到重要作用，但是HoxA9、HoxB13、HoxC4、HoxC5和HoxC8在前列腺癌的形成過(guò)程中異常表達(dá)［17］。

圖3　HoxB8 mRNA及蛋白表達(dá)的檢測(cè)

圖4　HoxB8對(duì)RKO細(xì)胞增殖能力的影響

圖5　HoxB8對(duì)RKO細(xì)胞遷移能力的影響

Hox基因家族成員之一HoxB8位于17號(hào)染色體上［1］。Vider等［3］研究表明HoxB8在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其結(jié)果顯示HoxB8可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生相關(guān)。此外在小鼠胚胎中發(fā)現(xiàn)miRNA-196a介導(dǎo)HoxB8 mRNA的分解，并且體外研究發(fā)現(xiàn)HoxB8表達(dá)下調(diào)與miRNA-196a有關(guān)，此研究結(jié)果顯示在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育中miRNA-196a介導(dǎo)調(diào)控HoxB8基因的表達(dá)［18］。另外Schimanski等［19］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-196a的表達(dá)量增加能夠促進(jìn)癌細(xì)胞分離、轉(zhuǎn)移、侵襲以及提高其對(duì)platin衍生物的化學(xué)敏感性，但是對(duì)癌細(xì)胞的增殖和凋亡影響不大。因此，miRNA-196a可能通過(guò)調(diào)控HoxB8基因表達(dá)影響癌細(xì)胞的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移以及侵襲。Sugimachi等［20］研究發(fā)現(xiàn)在肝癌中HoxB8是miRNA-718的潛在靶點(diǎn)，并且其表達(dá)上調(diào)與不良預(yù)后有關(guān)。提示HoxB8基因可能作為結(jié)直腸癌的治療靶點(diǎn)。

本研究成功構(gòu)建Lenti-HoxB8-GFP慢病毒表達(dá)載體，通過(guò)病毒包裝后獲得高滴度的慢病毒顆粒。用此病毒感染RKO細(xì)胞后，可在熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光，同時(shí)Real-time PCR及Western blot法檢測(cè)到HoxB8 mRNA和蛋白的高表達(dá)。MTT和細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)顯示HoxB8基因過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，同時(shí)HoxB8能夠增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力。陳玉燕等［21］研究發(fā)現(xiàn)NF-κB和MMP-9的高表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移高度相關(guān)，因此在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中這三者之間可能存在著某種聯(lián)系。黃立勇等［22］研究發(fā)現(xiàn)miRNA-196和HoxB8的表達(dá)差異可能與結(jié)直腸癌患者對(duì)Folfox4方案的化療敏感性相關(guān)，HoxB8的表達(dá)水平可能通過(guò)受到miRNA-196的調(diào)控從而影響Folfox4化療敏感性。Li等［23］經(jīng)研究預(yù)測(cè)HoxB8可能作為預(yù)測(cè)FOLFOX4對(duì)結(jié)直腸癌患者治療效果的標(biāo)志物。同樣在Lu等［2］的研究中，也發(fā)現(xiàn)以HoxB8等7個(gè)基因?yàn)榛A(chǔ)建立的基因預(yù)測(cè)模型在預(yù)測(cè)FOLFOX4對(duì)肝轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者的化學(xué)治療敏感性具有較高的精確度。而胡萬(wàn)樂(lè)等［24］研究發(fā)現(xiàn)3-甲基腺嘌呤能夠影響人耐藥大腸癌SW480細(xì)胞的增殖和自噬活動(dòng)，并且與5-FU聯(lián)用能夠提高化療效果。因此或許通過(guò)調(diào)控HoxB8基因的表達(dá)，影響結(jié)直腸癌對(duì)化療藥物的敏感性，降低藥物有效治療濃度會(huì)是一個(gè)新的突破口。HoxB8可能可以作為結(jié)直腸癌新的治療靶點(diǎn)。本研究成功構(gòu)建了HoxB8慢病毒顆粒以及HoxB8過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型，并初步證明HoxB8基因?qū)Y(jié)直腸癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的影響，為進(jìn)一步研究HoxB8基因在結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能、分子機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。

［1］Yue Y， Farcas R， Thiel G， et al. De novo t （12；17） （p13.3；q21.3） translocation with a breakpoint near the 5’ end of the HOXB gene cluster in a patient with developmental delay and skeletal malformations［J］. Eur J Hum Genet， 2007， 15 （5）: 570-577.

［2］Lu X， Pan J， Li S， et al. Establishment of a predictive genetic model for estimating chemotherapy sensitivity of colorectal cancer with synchronous liver metastasis［J］. Cancer Biother Radiopharm， 2013， 28（7）: 552-558.

［3］Vider BZ， Zimber A， Chastre E， et al. Deregulated expression of homeobox-containing genes， HOXB6， B8， C8， C9， and Cdx-1， in human colon cancer cell lines［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2000， 272（2）: 513-518.

［4］Scott MP. Vertebrate homeobox gene nomenclature［J］. Cell，1992， 71（4）: 551-553.

［5］Kanai M， Hamada J， Takada M， et al. Aberrant expressions of HOX genes in colorectal and hepatocellular carcinomas ［J］. Oncol Rep， 2010， 23（3）: 843-851.

［6］Cantile M， Scognamiglio G， La Sala L， et al. Aberrant expression of posterior HOX genes in well differentiated histotypes of thyroid cancers［J］. Int J Mol Sci， 2013， 14（11）: 21727-21740.

［7］Marra L， Cantile M， Scognamiglio G， et al. Deregulation of HOX B13 expression in urinary bladder cancer progression ［J］. Curr Med Chem， 2013， 20（6）: 833-839.

［8］Bhatlekar S， Fields JZ， Boman BM. HOX genes and their role in the development of human cancers［J］. J Mol Med （Berl）， 2014， 92（8）: 811-823.

［9］Calvo KR， Sykes DB， Pasillas MP， et al. Nup98-HoxA9 immortalizes myeloid progenitors， enforces expression of Hoxa9，Hoxa7 and Meis1， and alters cytokine-specific responses in a manner similar to that induced by retroviral co-expression of Hoxa9 and Meis1［J］. Oncogene， 2002， 21（27）: 4247-4256.

［10］Vider BZ， Zimber A， Hirsch D， et al. Human colorectal carcinogenesis is associated with deregulation of homeobox gene expression［J］. Biochem Biophys Res Commun， 1997，232（3）: 742-748.

［11］Liao WT， Jiang D， Yuan J， et al. HOXB7 as a prognostic factor and mediator of colorectal cancer progression［J］. Clin Cancer Res， 2011， 17（11）: 3569-3578.

［12］Hur H， Lee JY， Yun HJ， et al. Analysis of HOX gene expression patterns in human breast cancer［J］. Mol Biotechnol， 2014， 56（1）: 64-71.

［13］Makiyama K， Hamada J， Takada M， et al. Aberrant expression of HOX genes in human invasive breast carcinoma［J］. Oncol Rep， 2005， 13（4）: 673-679.

［14］Chen H， Chung S， Sukumar S. HOXA5-induced apoptosis in breast cancer cells is mediated by caspases 2 and 8［J］. Mol Cell Biol， 2004， 24（2）: 924-935.

［15］Shaoqiang C， Yue Z， Yang L， et al. Expression of HOXD3 correlates with shorter survival in patients with invasive breast cancer［J］. Clin Exp Metastasis， 2013， 30（2）: 155-163.

［16］Waltregny D， Alami Y， Clausse N， et al. Overexpression of the homeobox gene HOXC8 in human prostate cancer correlates with loss of tumor differentiation［J］. Prostate， 2002，50（3）: 162-169.

［17］Javed S， Langley SE. Importance of HOX genes in normal prostate gland formation， prostate cancer development and its early detection［J］. BJU Int， 2014， 113（4）: 535-540.

［18］Yekta S， Shih IH， Bartel DP. MicroRNA-directed cleavage of HOXB8 mRNA［J］. Science， 2004， 304（5670）: 594-596.

［19］Schimanski CC， Frerichs K， Rahman F， et al. High miR-196a levels promote the oncogenic phenotype of colorectal cancer cells［J］. World J Gastroenterol， 2009， 15（17）: 2089-2096.

［20］Sugimachi K， Matsumura T， Hirata H， et al. Identification of a bona fide microRNA biomarker in serum exosomes that predicts hepatocellular carcinoma recurrence after liver transplantation［J］. Br J Cancer， 2015， 112（3）: 532-538.

［21］陳玉燕， 謝杰斌， 陳榮， 等. NF-κB和MMP-9在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義［J］. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 41（6）: 545-549.

［22］黃立勇， 潘杰， 盧星榕， 等. miR-196和HoxB8與結(jié)直腸癌Folfox4化療敏感性的相關(guān)研究［J］. 中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志， 2014， 21（1）: 35-40.

［23］Li S， Lu X， Chi P， et al. Identification of HOXB8 and KLK11 expression levels as potential biomarkers to predict the effects of FOLFOX4 chemotherapy［J］. Future Oncol， 2013， 9 （5）: 727-736.

［24］胡萬(wàn)樂(lè)， 王玲琴， 陳蘇萍， 等. 3-甲基腺嘌呤對(duì)人耐藥大腸癌SW480細(xì)胞增殖及自噬活性的影響［J］. 溫州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 44（3）: 189-192.

（本文編輯：胡苗苗）

Effect of HoxB8 gene on colon cancer cells growth and migration

LIN Feiyan1， WU Aihua1， ZHANG Peili1，JIANG Lei1， LI Shaotang2.
1.Laboratory of Internal Medicine， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015； 2.Department of General Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou， 325015

Objective: To construct a lentiviral vector Lenti-HoxB8-GFP that containing human HoxB8 gene and investigate its role in colon cancer cells. Methods: The HoxB8 gene was amplified and cloned into a lentiviral vector by restriction endonuclease EcoR I/SAC II digestion and T4 DNA ligase ligation to form recombinant Lenti-HoxB8-GFP. The positive clones were identified by PCR and sequencing， after transformation into E. coli cells. Lentivirus were produced by co-transfection of lentiviral vector and the three packaging vector into 293T cells. The RKO cells were transduced with Lenti-HoxB8-GFP and the expression of HoxB8 was detected by Real-time PCR and western blotting Cell proliferation and colony forming ability were detected by MTT and plate clone assay. Cell migration was measured by Transwell assay. Results: The lentiviral vector Lenti-HoxB8-GFP containing HoxB8 gene was successfully constructed. Most of the cells had strong green fluorescence after transfected with the collected virus for 72 h. Real-time PCR and western blotting verified the overexpression of HoxB8 in the transfected RKO cells. Overexpression of HoxB8 promoted RKO cell proliferation and cell colony formation. Moreover， overexpression of HoxB8 increased colorectal cancer cell migration. Conclusion: HoxB8 gene promoted proliferation， cell colony formation and cell migration in colorectal cancer RKO cells.

HoxB8； lentiviral vector； colorectal neoplasms； Real-time PCR； Western blot

R733

A DOI: 10.3969/j.issn.2095-9400.2015.11.002

2015-04-03

浙江省教育廳科研基金資助項(xiàng)目（Y201326738）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013KYA129）；溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20140667）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY15H160057）。

林飛燕（1987-），女，浙江溫州人，助理實(shí)驗(yàn)員。

李紹堂，副主任醫(yī)師，Email：lishaotang163@163. com。