張爽

（遼寧省錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

豬圓環(huán)病毒2型培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)

張爽

（遼寧省錦州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 錦州 121000）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種豬的傳染病，主要感染仔豬或青年豬。主要臨床表現(xiàn)為斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬呼吸道疾病綜合征、豬皮炎與腎炎綜合征、母豬繁殖障礙、肉芽腫性腸炎、壞死性淋巴結(jié)炎。防控豬圓環(huán)病毒病的最佳手段是疫苗免疫，病毒的毒價(jià)與疫苗的免疫原性關(guān)系密切，本試驗(yàn)從病毒接種劑量、D-氨基葡萄糖濃度和病毒培養(yǎng)時(shí)間等方面優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高病毒培養(yǎng)液的毒價(jià)，為研制豬圓環(huán)病毒2型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及病毒

PK15細(xì)胞：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所豬圓環(huán)病毒：自行分離鑒定

1.2病毒含量的測(cè)定

將病毒液用2%牛血清MEM做10倍系列稀釋，取104、105、1063個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的PK-15細(xì)胞各5個(gè)復(fù)孔，在37℃條件下培養(yǎng)，用IFA方法進(jìn)行染色，計(jì)算TCID50

1.3病毒繁殖條件的優(yōu)化

1.3.1病毒接種劑量本試驗(yàn)采用同步接毒法，分別按1%、2%、3%、5%和10%劑量同步接種PK-15細(xì)胞，同時(shí)在培養(yǎng)液中添加3mmol/L D-氨基葡萄糖，置于37℃培養(yǎng)，144h后收毒，將收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，3000r/min，離心10min，取上清液，測(cè)定毒價(jià)，確定最佳接毒劑量。

1.3.2D-氨基葡萄糖濃度的確定本試驗(yàn)按5%劑量同步接種 PK-15細(xì)胞，分別添加終濃度為 0、0.5mmol/L、1 mmol/L、3mmol/L、6mmol/L、8mmol/L的D-氨基葡萄糖，置于37℃培養(yǎng)，144h后收毒，將收獲的病毒液反復(fù)凍融3次，3000r/min，離心10min，取上清液，測(cè)定毒價(jià)，確定D-氨基葡萄糖的最佳濃度。

1.3.3病毒的最佳收毒時(shí)間的確定按5%劑量同步接種PK-15細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入終濃度為3%的D-氨基葡萄糖，置于37℃培養(yǎng)，分別于0h、24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h收獲病毒液，反復(fù)凍融3次，3000r/min，離心10min，取上清液，測(cè)定毒價(jià)，確定病毒的最佳收獲時(shí)間。

2　結(jié)果

2.1病毒接種劑量

表1　不同接種劑量的毒價(jià)結(jié)果

由表1可以看出，病毒接種劑量在1%～5%時(shí)，隨著接種劑量的增加，病毒的毒價(jià)也增加，當(dāng)病毒接種劑量達(dá)到5%時(shí)，病毒含量為106.6 TCID50/mL。當(dāng)病毒接種量達(dá)到10%時(shí)，病毒含量只為106.0TCID50/mL。由此可見，確定以5%毒種劑量接種細(xì)胞繁殖病毒。

2.2D-氨基葡萄糖濃度的確定

表2　不同D-氨基葡萄糖濃度病毒液的毒價(jià)結(jié)果

由表2可以看出，D-氨基葡萄糖濃度在0～3mmol/L時(shí)，病毒的毒價(jià)隨著D-氨基葡萄糖濃度的升高而升高，當(dāng)D-氨基葡萄糖濃度超過3mmol/L時(shí)，病毒毒價(jià)逐漸下降，因此，在培養(yǎng)液中添加3mmol/LD-氨基葡萄糖時(shí)，最適合病毒增值。

2.3病毒的最佳收毒時(shí)間的確定

表3　不同培養(yǎng)時(shí)間下病毒液的毒價(jià)結(jié)果

由表3可以看出，在接種后144h收獲病毒液，病毒的毒價(jià)最高。當(dāng)培養(yǎng)至168h時(shí)，病毒液的毒價(jià)降至105.3TCID50/mL。因此，最佳收獲時(shí)間確定為144h。

3　討論

疫苗免疫是防控豬圓環(huán)病毒病的最佳手段，病毒毒價(jià)的高低影響著疫苗的免疫效果。探索最佳的接毒劑量，既節(jié)約成本，又有效的提高病毒液的毒價(jià)。豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）生物學(xué)特性比較特殊，在PK-15細(xì)胞中增殖的滴度不高，在病毒培養(yǎng)液中加入適量的D-氨基葡萄糖有利于病毒的復(fù)制，確定D-氨基葡萄糖加入濃度，可以有效的提高病毒的毒力。但對(duì)其作用的機(jī)制尚不清楚。另外，掌握好病毒培養(yǎng)的時(shí)間，能有效降低病毒毒力的損耗。綜合上述因素，本試驗(yàn)對(duì)豬圓環(huán)病毒2型培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，按5%終濃度同步接種PK-15細(xì)胞，在培養(yǎng)液中加入3mmol/mL的D-氨基葡萄糖，置于37℃培養(yǎng)，144h后收毒，測(cè)定的病毒含量最高。

10.3969/J.ISSN.1671-6027.2015.07.024