馬明侖，宋志元，張新蕾，張要齊，張軍輝，孫雪峰

（1.新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 新鄉(xiāng)　453700；2.河南惠通天下生物工程有限公司）

飼用糞腸球菌培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化研究

馬明侖1，宋志元2，張新蕾2，張要齊2，張軍輝2，孫雪峰2

（1.新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)檢驗(yàn)中心，河南 新鄉(xiāng)453700；2.河南惠通天下生物工程有限公司）

為提高飼用糞腸球菌發(fā)酵活菌數(shù)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化試驗(yàn)對(duì)糞腸球菌的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為蛋白胨3.2%，酵母粉1%，葡萄糖2.8%，吐溫-80 1 ml/L，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，碳酸鈣1.0%。最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)基初始pH（7.1i 0.1），接種量2.5%～5.0%，溫度34～37℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)。在最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下，糞腸球菌活菌數(shù)最高可達(dá)8.5 109cfu/ml。

糞腸球菌；發(fā)酵；正交試驗(yàn)；優(yōu)化

隨著科技的進(jìn)步和人們對(duì)健康、綠色畜禽產(chǎn)品的需求，益生菌作為抗生素的替代品越來(lái)越受到人們的關(guān)注及深入研究［1］。

糞腸球菌是革蘭氏陽(yáng)性菌，1994年出版的《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》將該菌列為腸球菌屬［2］。糞腸球菌存在于人和大多數(shù)動(dòng)物的腸道內(nèi)，是人體腸道內(nèi)的重要菌群，能耐受胃酸和膽汁酸的作用［3］。糞腸球菌制作成微生態(tài)飼料添加劑，可以對(duì)宿主胃腸道進(jìn)行微生態(tài)調(diào)節(jié)，增強(qiáng)動(dòng)物免疫力［4］，不僅具有提高畜禽生產(chǎn)性能和防治疾病的作用，而且還具有無(wú)污染、無(wú)耐藥性和無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高糞腸球菌的活菌數(shù)，為糞腸球菌制劑工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1　試驗(yàn)材料

1.1菌種

糞腸球菌，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.2培養(yǎng)基

檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母粉1%，葡萄糖2%，吐溫-80 1 ml/L，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸三銨0.2%，無(wú)水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，無(wú)水乙酸鈉0.5%，溴甲酚紫0.006%，瓊脂1.5%，pH（7.1i 0.1）。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨2%，酵母粉0.5%，葡萄糖2%，吐溫-80 1 ml/L，磷酸氫二鉀0.2%，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，無(wú)水乙酸鈉0.5%，pH（7.1i 0.1）。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨3.2%，酵母粉1%，葡萄糖3.4%，吐溫-80 1 ml/L，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，碳酸鈣1.0%，pH（7.1i 0.1）。

2　試驗(yàn)方法

2.1糞腸球菌種子培養(yǎng)及發(fā)酵

種子培養(yǎng)：以0.5%的接種量，將斜面種子接種至種子培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)10 h，即為種子液。

發(fā)酵：以5%的接種量，將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)至碳酸鈣消失。

2.2發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1碳酸鈣含量的確定

將碳酸鈣以0%、0.5%、0.8%和1.0%的添加量添加至發(fā)酵培養(yǎng)基中，根據(jù)碳酸鈣消失情況和活菌數(shù)選取最優(yōu)碳酸鈣含量。

2.2.2正交優(yōu)化試驗(yàn)

選取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等3個(gè)影響因素，采用L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以發(fā)酵液糞腸球菌活菌數(shù)為指標(biāo)，確定葡萄糖、蛋白胨和酵母粉的添加量（見(jiàn)表1），每次處理3個(gè)重復(fù)。

表1　正交試驗(yàn)的因素和水平

2.3發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1培養(yǎng)方式對(duì)發(fā)酵的影響

分別以靜置、100 r/min、150 r/min進(jìn)行發(fā)酵，根據(jù)碳酸鈣消失情況和活菌數(shù)確定培養(yǎng)方式。

2.3.2培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵的影響

用3 mol/L的鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH分別為6.6、7.1、7.6，發(fā)酵完成后，根據(jù)碳酸鈣消失情況和活菌數(shù)確定最佳初始pH。

2.3.3發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵的影響

分別在33℃、37℃、41℃溫度條件下，進(jìn)行發(fā)酵，根據(jù)碳酸鈣消失情況和活菌數(shù)確定最佳發(fā)酵溫度。

2.3.4接種量對(duì)發(fā)酵的影響

分別以2.5%、5.0%和10%的接種量，將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵完成后，根據(jù)碳酸鈣消失情況和活菌數(shù)確定最佳接種量。

2.3檢測(cè)方法

2.3.1pH檢測(cè)

用pH計(jì)直接檢測(cè)發(fā)酵，記錄結(jié)果。

2.3.2吸光度檢測(cè)

將發(fā)酵液稀釋適宜濃度，以稀釋相同倍數(shù)的空白培養(yǎng)基作對(duì)照，在600 nm處測(cè)稀釋發(fā)酵液的吸光值，使數(shù)值在0.2～0.8之間，記錄結(jié)果。

2.3.3活菌數(shù)的檢測(cè)

用無(wú)菌生理鹽水稀釋發(fā)酵液至適宜濃度，吸取0.1 ml至活菌計(jì)數(shù)平板上，涂布均勻，37℃倒置培養(yǎng)36～48 h，記錄結(jié)果。

3　結(jié)果

3.1發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

3.1.1碳酸鈣含量對(duì)發(fā)酵的影響（見(jiàn)圖1）

如圖1所示，發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加碳酸鈣時(shí)，發(fā)酵情況較差，活菌數(shù)非常低。當(dāng)添加0.5%、0.8%和1.0%的碳酸鈣時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)均較高，但碳酸鈣含量為1.0%，發(fā)酵14 h時(shí)，碳酸鈣含量仍未消失完全；碳酸鈣含量為0.5%和0.8%時(shí)，碳酸鈣均消失。故選擇碳酸鈣含量為0.5%。

圖1　碳酸鈣含量對(duì)糞腸球菌發(fā)酵的影響

3.1.2正交試驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)表2）

表2表明，各因素對(duì)于正交優(yōu)化試驗(yàn)的影響順序依次為：蛋白胨＞葡萄糖＞酵母粉，最佳組合為B2A1C2，即葡萄糖添加量為2.8%，蛋白胨添加量為3.2%，酵母粉添加量為1.0%。

表2　正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果

3.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

3.2.1培養(yǎng)方式對(duì)發(fā)酵的影響

在靜置或100 r/min的發(fā)酵條件下，發(fā)酵液中碳酸鈣均未消失，且活菌數(shù)較低；而在150 r/min的發(fā)酵條件下，發(fā)酵液中碳酸鈣均已消失，活菌數(shù)也較高。

3.2.2培養(yǎng)基初始pH對(duì)發(fā)酵的影響（見(jiàn)圖2）

圖2所示，當(dāng)初始pH較高時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)較低；初始pH為7.1時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)較高，達(dá)到74億/ml以上。故確定培養(yǎng)基初始pH為7.1i 0.1。

圖2　培養(yǎng)基初始pH對(duì)糞腸球菌發(fā)酵的影響

3.2.3溫度對(duì)發(fā)酵的影響（見(jiàn)圖3）圖3所示，發(fā)酵溫度為40℃時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)較低；發(fā)酵溫度為34℃和37℃時(shí)，發(fā)酵液活菌數(shù)分別達(dá)68億/ml和70.8億/ml，差別不大，故發(fā)酵溫度可控制在34～37℃。

3.2.4接種量對(duì)發(fā)酵的影響（見(jiàn)圖4）

圖4所示，接種量為2.5%和5.0%時(shí)，發(fā)酵液的吸光度和活菌數(shù)差別不明顯，OD600為0.79左右，活菌數(shù)達(dá)75億/ml左右。而接種量為10.0%時(shí)，發(fā)酵液的吸光度和活菌數(shù)均較低。故確定接種量為2.5%～5.0%。

發(fā)酵液初始活菌數(shù)對(duì)發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)的影響（見(jiàn)圖5）。結(jié)果顯示發(fā)酵液初始活菌數(shù)每毫升為0.48億～1.15億時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)均達(dá)到70億/ml以上；其中發(fā)酵液初始菌數(shù)為0.99億/ml時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后活菌數(shù)達(dá)到85億/ml。

圖3　溫度對(duì)糞腸球菌發(fā)酵的影響

圖4　接種量對(duì)糞腸球菌發(fā)酵的影響

4　結(jié)論

圖5　初始活菌數(shù)對(duì)糞腸球菌發(fā)酵的影響

通過(guò)對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定糞腸球菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為蛋白胨3.2%，酵母粉1%，葡萄糖2.8%，吐溫-80 1 ml/L，檸檬酸三銨0.2%，七水硫酸鎂0.02%，一水硫酸錳0.005%，碳酸鈣1.0%，初始pH（7.1i 0.1）。采用最佳發(fā)酵培養(yǎng)基、初始pH（7.1i 0.1）、接種量2.5%～5.0%、溫度34～37℃，以150 r/min振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵液中糞腸球菌活菌數(shù)最高可達(dá)8.5 109cuf/ml以上。

［1］劉虎傳，張敏紅，姜海龍.益生腸球菌的研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2011，23（12）：2090-2096.

［2］Hot G J，Krieg R N，Sneath H A P，等.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)·第9版［M］.北京：科學(xué)出版社，l994.

［3］沈中艷.豬源益生乳酸菌的篩選及發(fā)酵工藝研究［D］.碩士學(xué)位論文.武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007：10-18.

［4］王旭明，陳宗澤，袁毅.益生菌作用機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，27（1）：50-53.

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1004-5090（2015）06-0004-03

2015-04-18）