楊麗霞，邱華麗，彭新凱，宋濤平

（長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的建立

楊麗霞，邱華麗，彭新凱，宋濤平

（長(zhǎng)沙市食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

采用轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系特異性基因LAMP引物，建立2種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系特異性基因等溫?cái)U(kuò)增方法：（1）實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法；（2）反應(yīng)前加入染料羥基萘酚藍(lán)（HNB）作為L(zhǎng)AMP擴(kuò)增的指示劑，根據(jù)反應(yīng)后HNB的顏色變化進(jìn)行判定。對(duì)兩種方法進(jìn)行靈敏度、特異性測(cè)試，結(jié)果表明，兩種方法皆能快速、特異性檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系成分，定性檢測(cè)限為0.1%?；陬伾卸ǖ腖AMP檢測(cè)方法對(duì)設(shè)備要求更簡(jiǎn)單，更適用于日常檢驗(yàn)及監(jiān)管部門進(jìn)行轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測(cè)。

轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；可視化檢測(cè)

自1993年第一個(gè)商品化的轉(zhuǎn)基因延遲成熟西紅柿在美國(guó)成功上市以來，轉(zhuǎn)基因作物的種植面積不斷擴(kuò)大，由1996年的170萬hm2增長(zhǎng)至2011年的1.6億hm2，增長(zhǎng)了94倍。轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展迅速。種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物為抗除草劑大豆，達(dá)6920萬hm2，占全球大豆種植面積的67%［1］。

對(duì)于轉(zhuǎn)基因食品的標(biāo)識(shí)管理，歐盟對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的最低限量規(guī)定為0.9%，日本、澳大利亞、新西蘭對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同規(guī)定，閾值從1%至5%不等。2002年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》規(guī)定，轉(zhuǎn)基因食品需強(qiáng)制進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)［2］。對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定性或定量檢測(cè)是貫徹標(biāo)識(shí)制度的重要前提。

普通PCR和熒光定量PCR是轉(zhuǎn)基因檢測(cè)最常用的方法，但這些方法對(duì)設(shè)備和技術(shù)的要求較高。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi等［3］于2000年研發(fā)的一種新穎的恒溫基因擴(kuò)增方法，具有操作簡(jiǎn)便、對(duì)儀器設(shè)備要求低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。LAMP擴(kuò)增反應(yīng)已應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆［4］、轉(zhuǎn)基因玉米［5］和轉(zhuǎn)基因水稻［6］檢測(cè)。本文將普通LAMP與實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，建立了實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目的基因擴(kuò)增情況；同時(shí)，應(yīng)用金屬離子指示劑羥基萘酚藍(lán)（hydroxy naphthol blue， HNB）判定反應(yīng)結(jié)果［7］，使LAMP的結(jié)果判斷更簡(jiǎn)單直觀，提供了一種轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系可視化快速檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料

轉(zhuǎn)基因大豆標(biāo)準(zhǔn)品：GTS40-3-2（1%），購(gòu)自北京北化恒信生物技術(shù)有限公司；進(jìn)口商品：大豆、大豆蛋白，河南省出入境檢驗(yàn)檢疫局江志毅老師饋贈(zèng)；樣品：豆?jié){、豆腐樣品和有機(jī)大豆購(gòu)自超市，2份河南大豆樣品、2份湖南大豆樣品。

1.2主要試劑儀器

1.2.1試劑DNA等溫?cái)U(kuò)增試劑盒：廣州迪澳生物科技有限公司；羥基萘酚藍(lán)（HNB）購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；100 bp DNA ladder、Premix TaqTM購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2.2儀器超微量核酸蛋白分析儀：BD1000，北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；PCR儀：Bio-rad PCR

擴(kuò)增儀；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：7500 FAST，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3DNA提取

轉(zhuǎn)基因大豆DNA和樣品DNA提取參照DNA抽提試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］的操作步驟。

表1　引物序列Table 1　Sequences of primers

1.4引物序列

轉(zhuǎn)基因大豆 GTS40-3-2品系特異性基因LAMP引物參照Zhang等［8］，序列見表1，由上海生工生物工程公司合成，HPLC純化。

1.5特異性分析

以轉(zhuǎn)基因大豆、非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米Mon863、水稻TT51-1等樣品DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，確定引物的特異性。25 μL LAMP 反應(yīng)體系：外引物（GTS-F3/GTS-B3） 0.2 μmol·L-1，內(nèi)引物（GTS-FIP /GTS-BIP） 1.6 μmol·L-1，環(huán)引物（GTS-LB/GTS-LF） 0.3 μmol·L-1，8 U Bst DNA聚合酶1 μL、2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL及100 ng·μL-1DNA模板1 μL。反應(yīng)條件：63 ℃，45 min；80 ℃，10 min。實(shí)時(shí)熒光LAMP法加SYTO-9熒光染料0.5 μL，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上完成反應(yīng)；顯色法加3 mmol·L-1HNB 0.5 μL，在普通PCR儀上完成反應(yīng)。

1.6靈敏度分析

將1% GTS40-3-2大豆粉與非轉(zhuǎn)基因大豆粉按比例混合，使轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2占總重的1%、0.5%、0.1%和0，用試劑盒提取基因組后，濃度調(diào)整為100 ng·μL-1。進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增時(shí)，每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)平行，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行監(jiān)測(cè)。普通LAMP擴(kuò)增后，通過觀察反應(yīng)管中液體顏色，驗(yàn)證擴(kuò)增反應(yīng)是否發(fā)生，如發(fā)生擴(kuò)增，溶液為天藍(lán)色，否則溶液為紫羅蘭色。

常規(guī)PCR采用Premix TaqTM，用引物（GTS-F3/GTS-B3）對(duì)不同濃度梯度的轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，該對(duì)引物可擴(kuò)增出214 bp核酸片段。常規(guī)PCR反應(yīng)體系：2×Premix Taq 12.5 μL，0.5 μL上游引物GTS-F3（10 μmol·L-1），0.5 μL下游引物GTS-B3（10 μmol·L-1），100 ng DNA 模板，補(bǔ)滅菌蒸餾水至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃10 min。

1.7實(shí)際樣品檢測(cè)

利用建立的2種LAMP方法對(duì)9份樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用普通PCR檢測(cè)，比較三種方法檢測(cè)效果。

2　結(jié)果與分析

2.1特異性試驗(yàn)

以非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米Mon863、水稻TT51-1等樣品DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，確定實(shí)時(shí)熒光LAMP法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的特異性。實(shí)時(shí)熒光LAMP法擴(kuò)增曲線見圖1： A，結(jié)果顯示反應(yīng)中僅轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的DNA模板有擴(kuò)增曲線，LAMP顯色法結(jié)果見圖1： B，僅轉(zhuǎn)基因大豆溶液呈現(xiàn)天藍(lán)色，表示為陽性，兩種反應(yīng)的結(jié)果一致，說明引物的特異性好。

2.2靈敏度試驗(yàn)

用1%、0.5%、0.1%、0轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2樣品DNA進(jìn)行靈敏度實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)熒光LAMP擴(kuò)增圖譜見圖2： A，LAMP顯色法結(jié)果見圖2： B。靈敏度試驗(yàn)表明，實(shí)時(shí)熒光LAMP法和LAMP顯色法的檢測(cè)低限均可達(dá)0.1%。

圖1　轉(zhuǎn)基因大豆LAMP特異性Fig. 1　LAMP specific amplification pattern of transgenic soybean

圖2　轉(zhuǎn)基因大豆LAMP靈敏度Fig. 2　LAMP sensitivity of GTS40-3-2

圖3　轉(zhuǎn)基因大豆普通PCR靈敏度Fig. 3　PCR sensitivity of GTS40-3-2

圖3為普通PCR靈敏度檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)引物的設(shè)計(jì)，擴(kuò)增的目的基因?yàn)?14 bp，通過電泳圖可看出含量低至0.1%的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2成分樣品也可檢測(cè)到。

2.3實(shí)際樣品檢測(cè)

實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果見表2。LAMP法與普通PCR的檢測(cè)結(jié)果完全一致，表明本文建立的LAMP法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆品系檢測(cè)性能，不僅可用于大豆的檢測(cè)，也可用于大豆制品的檢測(cè)。

3　討論

表2　實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2　Results of samples

本研究選取轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2外源插入序列的3′端設(shè)計(jì)引物，建立的轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2品系特異性基因?qū)崟r(shí)熒光LAMP和LAMP顯色檢測(cè)方法，與非轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因玉米、水稻等均沒有出現(xiàn)交叉反應(yīng)，表明引物特異性好。這2種方法的靈敏度與普通PCR均可達(dá)到0.1%，而劉津等［9］報(bào)道的轉(zhuǎn)基因大豆GTS-40-3-2顯色法的靈敏度為0.5%，故本研究建立的實(shí)時(shí)熒光LAMP法和顯色法比以前建立的顯色法靈敏度有所提高，能夠滿足檢測(cè)要求。本研究采用的商業(yè)化恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液可能有助于提高反應(yīng)的靈敏度。

實(shí)時(shí)熒光LAMP法利用雙鏈DNA結(jié)合熒光染料后產(chǎn)生熒光信號(hào)的特性，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物與熒光信號(hào)收集同步，樣品的擴(kuò)增結(jié)果可通過熒光信號(hào)直接讀取，不需要通過電泳、染色及濁度法進(jìn)行判定。目前，該技術(shù)已成功應(yīng)用于間日瘧原蟲［10］、瘧疾［11］、鮑曼不動(dòng)桿菌［12］、副溶血性弧菌［13］、金黃色葡萄球菌［14］和豬肉成分［15］的檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光LAMP法可實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，而且可以根據(jù)曲線的特征判定引物二聚體及反應(yīng)擴(kuò)增效率，能夠加快LAMP引物篩選及擴(kuò)增條件優(yōu)化過程。本文采用的熒光染料SYTO-9，是一種比SYBR Green更適合實(shí)時(shí)熒光LAMP的染料，因?yàn)槠浠€熒光較低，區(qū)分度更好［11］。

LAMP顯色法反應(yīng)結(jié)果可用肉眼直觀判斷，常用的染料有SYBR GreenⅠ和HNB等。高濃度SYBR GreenⅠ染料抑制LAMP反應(yīng)，必須反應(yīng)后加入，容易造成氣溶膠污染；低濃度SYBR GreenⅠ染料對(duì)LAMP反應(yīng)無干擾，但必須在實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀上反應(yīng)，顯示擴(kuò)增結(jié)果。HNB可以在反應(yīng)前加入且對(duì)反應(yīng)無干擾。本研究使用HNB指示劑建立的LAMP顯色法，陰性、陽性結(jié)果差別明顯，易于判斷，靈敏度與實(shí)時(shí)熒光LAMP法相同，表明基于HNB的LAMP顯色法結(jié)果可信。該方法無需開蓋操作，靈敏度又高，避免了氣溶膠污染，而且只要有水浴鍋即可進(jìn)行檢測(cè)，無需特殊儀器設(shè)備，具有便攜、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，在短時(shí)間內(nèi)能完成檢測(cè)，更適用于基層和進(jìn)出口岸進(jìn)行快速檢驗(yàn)。

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Establishment of Loop-mediated Isothermal Amplification Method for Detection of Transgenic Soybean GTS40-3-2 Strain

YANG Li-xia， QIU Hua-li， PENG Xin-kai， SONG Tao-ping
（Changsha Center of Supervision & Inspection on Food Quality Safety， Changsha 410013， Hunan China）

According to the specific loop-mediated isothermal amplification （LAMP） primers， two specific LAMP methods for the detection of the transgenic soybean GTS40-3-2 strain were established： （1） real-time fluorescence loop-mediated isothermal amplification （RT-LAMP）； （2）LAMP with hydroxy naphthol blue （HNB） dye as indicator. The specificity and sensitivity of these two methods were evaluated. The results indicated that the transgenic soybean GTS40-3-2 could be distinguished from several GM events and non-GM plants with limitation of dection of 0.1%. The LAMP assay with HNB dye requires only simple laboratory equipment and it is suitable for daily inspection and supervision departments for rapid detection of genetically modified ingredients.

transgenic soybean GTS40-3-2 strain； loop-mediated isothermal amplification； visual detection

10.3969/j.issn.1009-7791.2015.03.007

S565.1

A

1009-7791（2015）03-0213-05

2015-05-17

湖南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科研項(xiàng)目（2013KJJH11）

楊麗霞，博士，高級(jí)工程師，從事食品安全分子生物學(xué)研究。E-mail： yanglixia612@163.com