王明翠，董發(fā)勤，王彬，賀小春，劉立柱，孫仕勇，霍婷婷

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可吸入石英粉塵中的羥自由基在磷酸鹽緩沖溶液中的釋放規(guī)律

王明翠1, 2，董發(fā)勤2，王彬3，賀小春2，劉立柱3，孫仕勇3，霍婷婷2

(1. 西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽，621010；2. 西南科技大學(xué)固體廢物處理與資源化教育部重點實驗室，四川綿陽，621010；3. 西南科技大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，四川綿陽，621010)

定量研究可吸入石英粉塵中的羥自由基(·OH)在磷酸鹽緩沖溶液中的釋放規(guī)律。采用對苯二甲酸?熒光分光光度法，探討石英粒度、質(zhì)量濃度、粉?液作用時間以及粉塵新鮮度對羥自由基釋放的影響，并分析石英粉塵在緩沖溶液中釋放羥自由基的動力學(xué)特征。研究結(jié)果表明：石英在緩沖溶液中羥自由基的產(chǎn)生呈劑量?效應(yīng)和時間?效應(yīng)關(guān)系，且顆粒尺寸效應(yīng)明顯，結(jié)晶態(tài)二氧化硅比非晶態(tài)二氧化硅更易產(chǎn)生羥自由基；新鮮石英比陳舊石英更易產(chǎn)生羥自由基；在較短作用時間內(nèi)釋放羥自由基的累積濃度呈對數(shù)增長趨勢，羥自由基濃度隨石英表面(·O—Si)濃度變化而變化，·OH產(chǎn)生的機制可能與石英表面裸露的基團和緩沖溶液發(fā)生的復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)有密切關(guān)系。

羥自由基；可吸入顆粒；石英；熒光光譜；對苯二甲酸

羥自由基(·OH)是一種非?；钴S、進攻性極強的活性氧自由基，其對生物體危害極大，近年來成為科學(xué)工作者的研究熱點[1]。許多礦物表面都能通過一定途徑產(chǎn)生羥自由基[2]，在超細加工過程中，石英通過異裂和均裂，表面出現(xiàn)大量裸露的基團，自由基(·SiO，·Si和·SiO2等)較豐富[3]。新破碎石英表面自由基決定塵粒表面活性，對人體粉塵性疾病的形成和細胞的損害有著重要影響。新鮮石英粉遇水能夠產(chǎn)生羥自由基，但人體內(nèi)沒有清除該自由基的特征酶系[4]，由此可知吸入石英粉塵會嚴重影響人體健康。前期研究表明，石英粉塵產(chǎn)生自由基對細胞體系能造成一定影響，據(jù)細胞內(nèi)外活性氧和毒性指標(biāo)(脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等)認為石英產(chǎn)生自由基導(dǎo)致細胞的氧化損傷[5?7]，而對于石英粉塵在無機體系中產(chǎn)生羥自由基的關(guān)注較少[8]。因此，在模擬人體介質(zhì)環(huán)境下，研究可吸入石英粉塵在液相中釋放羥自由基具有重要意義，這將有別于石英粉塵刺激細胞產(chǎn)生自由基的定性研究，有助于闡明石英粉塵產(chǎn)生羥自由基量與其致細胞氧化損傷程度的關(guān)系。另外，由于·OH壽命短，濃度低，反應(yīng)活性強[9]，國內(nèi)外鮮有關(guān)于石英粉塵羥自由基定量的研究，快速、靈敏和實用的羥自由基定量檢測方法選擇顯得十分重要。為此，本文作者利用羥自由基捕獲劑——對苯二甲酸，借助熒光分光光度法[10]，以直接定量方式對可吸入石英粉塵在pH為中性的磷酸鹽緩沖溶液中產(chǎn)生的羥自由基進行探討，重點研究石英粒度、質(zhì)量濃度、粉?液作用時間以及粉塵新鮮度等因素對體系中羥自由基濃度的影響，以便為深入探討不同因素下可吸入石英粉塵羥自由基釋放對細胞氧化損傷機制提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器為：F?7000熒光分光光度計(日本HITACHI制造)；HZS?H水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司制造)；進口石英比色皿；1/萬天平(美國丹佛儀器北京有限公司制造)。

試劑為：對苯二甲酸(TA)；2-羥基對苯二甲酸(HOTP)；磷酸二氫鉀；十二水合磷酸氫二鈉；粒徑為10.0 ，5.0，2.5和1.0 μm的石英粉(-石英，純度為99%以上)；納米二氧化硅粉體。這些試劑均為AR級。此外，還有二次石英亞沸蒸餾水。

溶液配制：對苯二甲酸應(yīng)用液，濃度為1.0×10?2mol/L；磷酸鹽緩沖液，pH=7.14。

1.2 實驗方法

1.2.1 標(biāo)準曲線的制作

準確稱取一定質(zhì)量的HOTP，用緩沖液配制成濃度梯度為0.001，0.005，0.010，0.030，0.050，0.070，0.090，0.100和0.200 μmol/L HOTP工作液，將緩沖液作空白液。在最優(yōu)條件下(激發(fā)波長為316 nm，發(fā)射波長為423 nm，激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度均為10 nm)[10]，依次測定工作液熒光強度，并測得緩沖液熒光強度。HOTP熒光強度，并以熒光強度為縱坐標(biāo)，HOTP標(biāo)準濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。

1.2.2 羥基自由基濃度測定

稱取一定質(zhì)量石英粉塵(除探討新、舊石英粉塵自由基釋放區(qū)別外，對于其他實驗，使用前，均勻速手磨2 min后稱質(zhì)量)，裝入磨口錐形瓶中，依次加入緩沖溶液和對苯二甲酸，于37 ℃和180 r/min條件下水浴恒溫振蕩，用孔徑為0.22 μm的微孔濾膜過濾，在最優(yōu)條件下測濾液的熒光強度。每個樣品重復(fù)3次，取平均值，并計算標(biāo)準偏差。讀取濾液熒光強度峰值、未加石英粉的體系熒光強度0，羥自由基產(chǎn)生的量用相對熒光強度Δ=?0表示。其中，Δ越大，表明生成的羥自由基越多。根據(jù)HOTP標(biāo)準曲線，對熒光強度Δ與羥自由基濃度·OH關(guān)系曲線及體系羥自由基進行定量研究。

2 結(jié)果與討論

羥基自由基可進攻對苯二甲酸，從而產(chǎn)生單一的強熒光羥基化產(chǎn)物HOTP，其熒光強度與·OH 濃度線性相關(guān)，實驗獲得HOTP的標(biāo)準曲線方程為=2 081.3，相關(guān)系數(shù)2=0.999 5。羥自由基累積濃度計算公式為

·OH=HOTP=(μmol/L) (1)

其中：為標(biāo)準曲線的斜率；?為相對熒光強度。利用式(1)計算不同影響因素下石英生成羥自由基濃度。

2.1 不同粒度石英粉塵對體系羥自由基濃度的影響

可吸入石英粉塵作為大氣顆粒物的重要組成成分，對人體健康有著潛在威脅，其粒徑?jīng)Q定顆粒物在人體內(nèi)的不同沉積部位。粒徑越小，則越容易侵入人體細胞組織中[11]。粒徑小于10.0 μm的粉塵能進入呼吸系統(tǒng)[12]，粒徑為1.0~2.5 μm的細顆粒大部分沉積于肺部深層，納米顆粒則易與生物體細胞結(jié)合。根據(jù)不同粒徑顆粒物對人體健康的影響，本組實驗研究了不同粒徑石英粉和納米二氧化硅粉體以質(zhì)量濃度4 g/L在緩沖溶液中作用48 h后產(chǎn)生羥自由基的能力，結(jié)果如圖1所示(其中，“[ ]”表示濃度)。

1—空白；2—納米二氧化硅；3—10.0 μm；4—5.0 μm；5—2.5 μm；6—1.0 μm

從圖1可見：緩沖溶液中·OH濃度隨石英顆粒粒度的減小而增加，從0.018 μmol/L增加到0.071 μmol/L。石英粒徑越小，體系產(chǎn)生的羥自由基量越多。石英粉在超細加工過程中，顆粒表面出現(xiàn)大量裸露的基團，使石英顆粒具有很強的活性。石英顆粒與水作用后，表面·SiO和·Si等基團能發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng)，形成更穩(wěn)定的—SiOH；同時，失去質(zhì)子H的H2O隨即轉(zhuǎn)化為·OH。石英顆粒粒度越小，其比表面積越大，表面裸露基團也越多，進而生成的·OH越多；此外，在該體系中，納米二氧化硅也產(chǎn)生羥自由基，但結(jié)晶態(tài)的二氧化硅較非晶態(tài)的二氧化硅更容易產(chǎn)生羥自由基。這可能是為了使納米二氧化硅具有較好的分散性，在制備過程中已對顆粒表面進行改性，消除或減少了顆粒表面羥基數(shù)量[13]。由于納米尺寸效應(yīng)，納米物質(zhì)在水溶液中極易團聚，使得微環(huán)境極性降低，濾液極化率減小，斯托克斯位移減小，故納米二氧化硅作用后濾液的最大發(fā)射波長有藍移現(xiàn)象。

2.2 不同新鮮度石英顆粒對體系羥自由基濃度的影響

前期研究大多采用新鮮石英粉塵為模型材料，探討石英粉塵釋放羥自由基的規(guī)律，指出新鮮研磨的石英粉塵在緩沖溶液中能釋放羥自由基。為探討石英粉塵在水溶液中釋放羥自由基的機理，研究了粒徑為2.5 μm、質(zhì)量濃度為4 g/L、不同新鮮度石英粉塵與緩沖液作用48 h后釋放羥自由基的規(guī)律，實驗結(jié)果如圖2所示。

1—空白；2—陳舊石英粉塵；3—新鮮石英粉塵

從圖2可見：新鮮石英粉塵與陳舊石英(保存2月)相比在水溶液中釋放羥自由基的量高約5倍。石英在研磨過程中，有更多Si—O—Si鍵均裂和硅載自由基產(chǎn)生(·Si，·SiO，·SiOO)，且新鮮研磨的石英粉塵有更大的表面積，使其具有更強的活性，與水作用后，顆粒物表面的硅氧鍵極易水解，產(chǎn)生·OH，但粉塵表面活性會隨著時間的延續(xù)而衰減，逐漸“老化”[3]，因而，新鮮石英粉塵比陳舊石英粉塵能夠釋放更多的羥自由基。

2.3 不同質(zhì)量濃度的石英粉塵對體系羥自由基濃度的影響

可吸入石英顆粒物能夠?qū)е氯祟悏m肺以及其他呼吸系統(tǒng)疾病，其中，顆粒物濃度是重要影響因素，直接決定其在呼吸道中的沉積量[14?15]。本組實驗選取粒度為2.5 μm的石英粉，設(shè)計不同的質(zhì)量濃度，分別為0，0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，4.00和8.00 g/L，與緩沖液作用48 h后，測濾液熒光強度，結(jié)果如圖3所示。研究石英粉塵濃度對羥自由基濃度的影響，結(jié)果如圖4所示。

質(zhì)量濃度/(g×L?1)：1—0；2—0.20；3—0.40；4—0.80；5—1.60；6—4.00；7—8.00

圖4 不同質(zhì)量濃度羥自由基濃度

從圖4可見：隨著粉塵質(zhì)量濃度增大，體系中羥自由基的濃度明顯升高；在低粉塵質(zhì)量濃度體系中，羥自由基的濃度隨著石英粉濃度的增加而迅速升高，當(dāng)顆粒物質(zhì)量濃度從0.05 g/L增大到0.80 g/L時，其羥自由基濃度從0.000 6 μmol/L增至0.020 0 μmol/L，增大了30倍；當(dāng)顆粒物質(zhì)量濃度為0.80~4.00 g/L時，粉塵釋放羥自由基濃度呈線性遞增；當(dāng)顆粒物質(zhì)量濃度高于4.00 g/L時，自由基的濃度較顆粒物質(zhì)量濃度為0.80~4.00 g/L時的濃度的增長速率有所降低。這種現(xiàn)象可以解釋為：在對苯二甲酸量足夠且不變的情況下，當(dāng)粉塵質(zhì)量濃度小于0.80 g/L時，單位體積內(nèi)低濃度石英粉塵表面基團與水作用反應(yīng)劇烈，產(chǎn)生的羥自由基立即被捕獲，其濃度隨石英粉塵量的增加而增多；當(dāng)粉塵質(zhì)量濃度為0.80~4.00 g/L時，體系中石英粉塵表面基團與水作用產(chǎn)生的羥自由基的化學(xué)反應(yīng)達到平衡，其濃度隨粉塵濃度變化呈線性改變；當(dāng)石英粉塵質(zhì)量濃度大于4.00 g/L時，由于單位體積溶液中顆粒數(shù)量巨大，顆粒間的作用力(靜電力、分子間作用力等)的相互作用影響了顆粒與溶液之間的作用行為，減緩了自由基的生成速度。

2.4 不同作用時間對體系羥自由基濃度的影響

顆粒物吸入人體后，會對人體特定組織形成短期和長期毒性，顆粒物化學(xué)組分、濃度及在人體內(nèi)滯留時間決定其危害程度[16]。本組實驗選取粒度為2.5 μm的石英粉，質(zhì)量濃度為4.00 g/L，作用不同時間(0.02，2，4，6，10，12，24，48，72，96和144 h)后，測定濾液的熒光強度，研究石英粉與溶液作用時間對羥自由基濃度的影響，實驗結(jié)果如圖5所示。

作用時間/h：1—0.02；2—2；3—6；4—10；5—48；6—144

實驗中，對第1個測量值進行校正，校正時間為0.02 h。從圖5可見：石英粉塵遇水則產(chǎn)生羥自由基，且隨著作用時間的增加，濾液的熒光強度不斷升高，體系累積的羥自由基量持續(xù)增多，其中，短時間(10 h)內(nèi)，羥自由基生成量快速增多；當(dāng)作用時間超過48 h時，羥自由基累積量趨于穩(wěn)定。這可能是由于在短時間內(nèi)，石英表面裸露的活性基團數(shù)量多，單位時間內(nèi)表面基團與水作用產(chǎn)生羥自由基多，濾液熒光強度快速增大；隨著時間的延長，固定質(zhì)量的石英粉塵表面基團逐漸被反應(yīng)消耗，體系產(chǎn)生的羥自由基量越來越少，其累積濃度逐漸趨于穩(wěn)定。

2.5 石英粉塵釋放羥自由基動力學(xué)分析

石英粉塵在緩沖溶液中羥自由基隨時間濃度的動力學(xué)規(guī)律如圖5所示。通過分析發(fā)現(xiàn)·OH的生成量與作用時間符合對數(shù)函數(shù)關(guān)系，其動力學(xué)方程為

=0.006 3ln+0.020 9，2=0.934 7 (2)

其中：為·OH的生成量；為時間，且≥0.02 h。由式(2)可以看出·OH的生成量與時間呈正相關(guān)。對方程(2)求導(dǎo)得0.006 3/，表明隨時間的推移，·OH的產(chǎn)生速率逐漸降低。本研究在勻速振蕩環(huán)境下進行，與其在生物體內(nèi)被吞噬—釋放—再吞噬的動態(tài)過程相似，體系中羥自由基可在一定時間內(nèi)釋放；隨著石英在磷酸緩沖體系中浸泡時間的延長，·OH熒光強度逐步衰減直至消失，與前期研究利用ESR檢測石英·OH結(jié)果一致[17]，進而推測石英粉塵進入機體后所形成的·OH不會持續(xù)很久。由于對數(shù)函數(shù)值可以取到無限大，與自由基的生成實際上是矛盾的，所以，當(dāng)浸泡時間＞＞ 144 h時，方程(2)對于自由生成量的模擬無效。

為驗證動力學(xué)方程的有效性，通過與緩沖液作用時間分別為8 h和120 h的實驗進行討論，計算出作用8 h和120 h的羥自由基生成量，理論值分別為0.034 0 μmol/L和0.051 1 μmol/L，實際值分別為0.032 0 μmol/L和0.050 8 μmol/L，經(jīng)SPSS統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，理論值與實際值沒有顯著性差異，故該動力學(xué)方程是正確、有效的。

石英粉塵在水溶液中產(chǎn)生·OH的機理主要涉及以下反應(yīng)[17?18]：

·O—Si+H2O→SiOH+·OH，反應(yīng)速率常數(shù)為3(3)

·O—Si+·OH→SiOOH，反應(yīng)速率常數(shù)為4(4)

SiOOH+H2O→SiOH+H2O2，反應(yīng)速率常數(shù)為5(5)

·Si+H2O2→SiOH+·OH，反應(yīng)速率常數(shù)為6(6)

由于體系中[·O—Si]和[·Si]很低，加入大量對苯二甲酸(TA)后，反應(yīng)(3)和(6)產(chǎn)生的·OH全部與TA反應(yīng)，進一步轉(zhuǎn)化為HOTP：

·OH+TA → HOTP，反應(yīng)速率常數(shù)為7(7)

根據(jù)質(zhì)量作用定律可以得到：

6[·Si][H2O2]?7[·OH][TA] (8)

TA與·OH反應(yīng)速率，即HOTP的生成速率為

將式(11)代入式(12)得

可見：HOTP的生成速率和·OH的濃度隨著石英表面[·O—Si]濃度的變化而變化，與[·Si]濃度無明顯關(guān)系。據(jù)反應(yīng)式(7)，羥自由基與對苯二甲酸以摩爾比1:1反應(yīng)生成HOTP。由于隨著反應(yīng)的進行，[·O—Si]的濃度逐漸降低，而[H2O]可以認為是常數(shù)，表明HOTP生成速率呈降低趨勢，進而反映出·OH的生成速率是逐漸降低的。該規(guī)律與圖5所示結(jié)果是一致的，因而，可依方程式(13)對石英粉塵水溶液中自由基的生成速率進行估算。

石英粉塵在水溶液中產(chǎn)生羥自由基的機制并未完全明晰，但通過新、舊石英粉塵釋放羥自由基的不同，石英粉塵釋放羥自由基具有明顯的劑量?效應(yīng)等一系列變化規(guī)律，可以間接地說明水溶液中石英粉塵產(chǎn)生羥自由基的機制并不是微量元素發(fā)生的Fenton反應(yīng)[19]。石英粉塵在水溶液中產(chǎn)生·OH的機制極可能是由于表面裸露的基團與溶液之間發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)。

3 結(jié)論

1) 石英粉塵在磷酸鹽緩沖溶液中釋放的羥自由基濃度很低，在本實驗條件下，羥自由基濃度為 0.000 6~0.080 0 μmol/L。

2) 粉塵粒度、濃度、粉塵新鮮度與溶液作用時間等均可影響石英粉塵釋放羥自由基能力；磷酸鹽緩沖溶液中石英粉塵釋放羥自由基呈劑量?效應(yīng)和時間?效應(yīng)關(guān)系，顆粒尺寸效應(yīng)明顯，且顆粒尺寸效應(yīng)從大至小的顆粒粒度為1.0，2.5，5.0和10.0 μm，不同粒徑可吸入石英粉塵釋放羥自由基濃度均大于納米二氧化硅濃度。

3) 石英表面活性存在“老化”問題，新鮮石英粉塵較陳、舊石英(保存2月)在水溶液中釋放羥自由基能力強5倍。

4) 石英粉塵在磷酸鹽緩沖液中隨時間的延長，其羥自由基濃度減少，在研究時間范圍內(nèi)呈對數(shù)增長關(guān)系，可采用動力學(xué)方程=0.006 3ln+0.020 9對短時間內(nèi)石英粉塵在水溶液中釋放·OH進行定量計算；·OH的濃度只與石英表面(·O—Si)的濃度有關(guān)。

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Release of hydroxyl radicals from inhalable quartz dust in phosphate buffer solution

WANG Mingcui1, 2, DONG Faqin2, WANG Bin3, HE Xiaochun2, LIU Lizhu3, SUN Shiyong3, HUO Tingting2

(1. School of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China;2. Key Laboratory of Solid Waste Treatment and Resource Recycle of Ministry of Education, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China;3. School of Environment and Resource, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China)

The release of hydroxyl radicals from inhalable quartz dust in phosphate buffer solution was studied by direct quantitative method. The terephthalic acid-fluorescence spectrophotometry analysis was used to track the effect of the different grain sizes, mass concentration, powder-liquid reaction times and the quartz freshness on the release of hydroxyl radicals. Moreover, the release kinetics of hydroxyl radicals in the system was also performed. The results show that the content of hydroxyl radicals generation has a dose-response and time-response relationship with the dramatic effect of particle sizes. Furthermore, the crystalline silica and fresh quartz dust generate hydroxyl radicals more easily than the amorphous one and aged quartz dust, respectively. Interestingly, the relationship between the time and the cumulative concentration hydroxyl radicals in initial stage is in accordance with logarithmic function, and the content of hydroxyl radicals is related with the levels of (·O—Si) in the surface of quartz. The mechanism for generation of the hydroxyl radicals in those inhalable quartz dust in the complex matrix can result in the complicated chemical reactions occuring in the surface of quartz particles.

hydroxyl radicals; inhalable particles; quartz; fluorescence spectroscopy; terephthalic acid

10.11817/j.issn.1672-7207.2015.05.053

P575.4

A

1672?7207(2015)05?1967?06

2014?06?10；

2014?08?22

國家自然科學(xué)基金重點資助項目(41130746)；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項目(41102213) (Project(41130746) supported by the National Natural Science Foundation of China; Project(41102213) supported by the National Natural Science Foundation of Youth Science Fund)

董發(fā)勤，教授，博士生導(dǎo)師，從事生態(tài)環(huán)境材料、礦物環(huán)境等研究；E-mail: fqdong@swust.edu.cn

(編輯 陳燦華)