婁利嬌，胡　萍*，湛劍龍，張玉龍，樊　敏（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

分離自貴州侗族苗族發(fā)酵肉中兩株乳酸菌的耐受特性分析

婁利嬌，胡萍*，湛劍龍，張玉龍，樊敏
（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025）

該試驗(yàn)對(duì)分離自貴州侗族苗族發(fā)酵肉中的彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）LAB26（SR6）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）LAB42（SR10-1）的耐受能力進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，2株乳酸菌均表現(xiàn)出良好的耐酸、耐滲透壓、耐亞硝酸鹽及人工模擬胃腸液耐受能力。2株乳酸菌均可在pH值為3.5的環(huán)境中生長良好，其中菌株SR6在pH值為1.5的環(huán)境中仍有生長，表現(xiàn)出較好的耐酸性；2株乳酸菌均可在8%NaCl溶液的環(huán)境中生長良好；2株乳酸菌在0～0.04%NaNO2條件下，代謝活躍，正常生長；2株乳酸菌在經(jīng)過人工模擬胃腸液處理3 h后，活菌數(shù)仍≥5.0×107CFU/mL。表明彎曲乳桿菌LAB26與戊糖片球菌LAB42均表現(xiàn)出良好的耐受性，可用于功能型食品的開發(fā)。

發(fā)酵肉；彎曲乳桿菌；戊糖片球菌；乳酸菌；耐受特性

貴州侗族苗族發(fā)酵肉制品以“酸”為特色，主要以豬肉和魚肉為原料，根據(jù)當(dāng)?shù)仫嬍沉?xí)慣添加甜米酒、糯米飯、生姜、大蒜，花椒粉、辣椒粉等輔料，采用自然發(fā)酵法進(jìn)行發(fā)酵制作，很好地保存了當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境中的有益微生物（主要是乳酸菌），不僅具有制作方式獨(dú)特、用料天然、風(fēng)味特殊（鮮、香、酸、辣）、貯存時(shí)間長等特點(diǎn)，還具有抗氧化、降膽固醇等益生作用［1-2］。近年來，發(fā)酵肉制品在國際上已作為功能性食品基料在食品工業(yè)及醫(yī)療的許多方面獲得了廣泛應(yīng)用［3］。乳酸菌是研究、應(yīng)用較廣泛的益生菌之一，也是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌群。研究報(bào)道，乳酸菌具有抗氧化、降膽固醇、降血壓、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等多種益生作用。但是，乳酸菌需要抵抗機(jī)體胃腸道的不良環(huán)境后才能發(fā)揮其益生功能。人體胃液的pH變化較大，正常胃液的pH值約為3.0，空腹或者食用酸性食物時(shí)，pH值約為1.5［4］，且胃部還含有胃蛋白酶等抑菌物質(zhì)，低pH環(huán)境及胃蛋白酶等抑菌物質(zhì)會(huì)阻礙乳酸菌的生長，并阻礙其進(jìn)入腸道發(fā)揮其益生作用。因此，乳酸菌的耐酸、耐鹽等耐受能力及其對(duì)胃腸道的耐受能力，也是評(píng)價(jià)其菌種優(yōu)良的重要指標(biāo)之一［5-6］。該實(shí)驗(yàn)中的受試菌株彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）LAB26（SR6）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）LAB42（SR10-1）［7］，均為實(shí)驗(yàn)室從貴州侗族苗族酸魚、酸肉中的乳酸菌進(jìn)行篩選所得，結(jié)果顯示這兩株乳酸菌具有較好的抗氧化作用［8-9］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)這兩株乳酸菌的耐酸、耐鹽、耐亞硝酸鹽能力及人工模擬胃腸道耐受能力進(jìn)行研究，以期其具有良好的耐受能力，為生產(chǎn)具有良好益生作用的發(fā)酵肉制品提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株來源

2株乳酸菌菌株SR6（彎曲乳桿菌LAB26）和SR10-1（戊糖片球菌LAB42）：均源自實(shí)驗(yàn)室分離的貴州侗族苗族酸魚、酸肉中的乳酸菌菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：稱取55.2 g MRS培養(yǎng)基粉末，溶于1 000 mL蒸餾水中，調(diào)pH值至6.2，121℃滅菌15 min，備用。

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS液體培養(yǎng)基中加1.8%的瓊脂，加熱溶解，調(diào)pH至6.2，121℃滅菌15 min，備用。

1.1.3試劑

胃蛋白酶（3 000 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；實(shí)驗(yàn)所用其他化學(xué)試劑均為分析純：市售。

1.2儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái)：蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；Micro17R微量高速冷凍離心機(jī)：美國Thermo Electron公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHS-3C數(shù)顯pH計(jì)：上海越平科學(xué)儀器有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱HZQ-X100：太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱HPX-9082 MEB：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌株24 h生長曲線及pH值的測(cè)定

將已活化的2株受試菌以3%接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)24h，每隔2 h取發(fā)酵液，在波長600 nm處測(cè)定其吸光度值（OD600nm）及pH值，以空白MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行測(cè)試3次，繪制菌株生長曲線及24 h pH值變化曲線。

1.3.2菌株耐酸能力的測(cè)定

將已活化的2株受試菌，以3%接種量分別接種于pH值分別為1.5、2.5、3.5、4.5、6.5［10］的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)，分別于0、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取發(fā)酵液，在波長600 nm處測(cè)定其吸光度值（OD600nm），以各自對(duì)應(yīng)pH值的空白MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行測(cè)試3次。

1.3.3菌株耐滲透壓能力的測(cè)定

將已活化的2株受試菌，以3%接種量分別接種于NaCl含量為0、2%、4%、6%、8%的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)，分別于0、2h、4h、6h、8h、24h取發(fā)酵液，在波長600nm處測(cè)定其吸光度值（OD600nm），以各自對(duì)應(yīng)NaCl含量的空白MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行測(cè)試3次。

1.3.4菌株耐亞硝酸鹽能力的測(cè)定

將已活化的2株受試菌，以3%接種量分別接種于NaNO2含量為0、0.01%、0.02%、0.03%、0.04%的MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)，分別于0、2 h、4 h、6 h、8 h、24 h取發(fā)酵液，在波長600 nm處測(cè)定其吸光度值（OD600nm），以各自對(duì)應(yīng)NaNO2含量的空白MRS液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，平行測(cè)試3次。

1.3.5人工模擬胃腸液耐受試驗(yàn)［11］

（1）人工模擬胃液的配制

采用《中華人民共和國藥典》（2010版）中的方法稍有改進(jìn)。取稀鹽酸（0.1 mol/L）16.4 mL，加蒸餾水稀釋至1 000 mL，121℃滅菌15 min。取100 mL上述液體，加1 g胃蛋白酶，充分溶解后，用微孔濾膜（孔徑0.20 μm）過濾除菌，備用。

（2）人工模擬腸液的配制

采用《中華人民共和國藥典》（2010版）中的方法稍有改進(jìn)。取KH2PO46.8g，加蒸餾水500mL溶解，用質(zhì)量濃度為4 g/L的NaOH溶液調(diào)pH值至6.8，加水稀釋至1 000 mL，121℃滅菌15 min。取100 mL上述液體，加1 g胰蛋白酶，充分溶解后，用微孔濾膜（孔徑0.20 μm）過濾除菌，備用。

（3）體外人工模擬胃腸道消化試驗(yàn)

乳酸菌發(fā)揮其功能特性的菌體濃度一般為106～109CFU/mL［12-15］，該試驗(yàn)采用的菌體濃度為109CFU/mL。將已活化的2株受試菌菌株，以3%接種量分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)18 h，3 500 r/min離心10 min，收集菌體，菌體經(jīng)無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌3次后重懸于PBS中，調(diào)整菌體濃度為109CFU/mL，備用。

準(zhǔn)確移取上述菌懸液1mL，在無菌操作下，置于150 mL滅菌錐形瓶中，加入20 mL人工胃液，同時(shí)將瓶子放入恒溫振蕩搖床37℃、90 r/min培養(yǎng)1 h。然后加入80 mL人工腸液，37℃，120 r/min繼續(xù)培養(yǎng)2 h。吸取1 mL培養(yǎng)后的菌懸液于9 mL生理鹽水中作系列梯度稀釋，稀釋到合適的濃度梯度，涂布于MRS平板上，采用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

（4）活菌計(jì)數(shù)及耐受率計(jì)算乳酸菌活菌計(jì)數(shù)采用平板菌落計(jì)數(shù)法［16］。人工模擬胃腸道耐受率計(jì)算公式如下：

2　結(jié)果與分析

2.1菌株24 h生長曲線及pH值變化的結(jié)果

乳酸菌生長曲線可反映乳酸菌的菌體數(shù)量、生長狀況及代謝情況等多個(gè)重要指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定菌株發(fā)酵液的pH值，可初步判定菌株的產(chǎn)酸能力。對(duì)2株乳酸菌SR6和SR10-1進(jìn)行了24 h生長曲線的繪制及pH值的測(cè)定，結(jié)果分別如圖1、圖2所示。

由圖1可知，菌株SR6和SR10-1的培養(yǎng)時(shí)間與OD600nm值均呈正比關(guān)系，且變化趨勢(shì)相似。在0～8 h內(nèi)，OD600nm值開始緩慢上升，菌體細(xì)胞開始緩慢生長；8 h后，OD600nm值呈直線上升，菌體細(xì)胞快速生長繁殖，代謝活躍，進(jìn)入對(duì)數(shù)期；到18 h時(shí)曲線趨于平緩，20 h達(dá)到生長高峰，此時(shí)菌體細(xì)胞的生長速率與死亡速率處于動(dòng)態(tài)平衡，開始積累代謝產(chǎn)物；在整個(gè)培養(yǎng)過程中，菌株SR6吸光度值始終高于菌株SR10-1，說明菌株SR6生長狀況優(yōu)于菌株SR10-1。通過生長曲線可以初步確定，菌株SR6與菌株SR10-1的菌體最佳收集時(shí)間為18～20 h。

圖1　菌株SR6、SR10-1的24 h生長曲線Fig.1 Growth curve of strain SR6 and SR10-1 in 24 h

圖2　菌株SR6、SR10-1的24 h pH值變化Fig.2 Change of pH value of strain SR6 and SR10-1 in 24 h

由圖2可知，2株乳酸菌SR6和SR10-1培養(yǎng)24 h的pH值變化趨勢(shì)相似，在0～4 h內(nèi)pH值變化較??；4～18 h內(nèi)，pH值下降明顯，pH值由6.0下降至3.5左右，此時(shí)間段正值菌株對(duì)數(shù)生長期，乳酸菌開始產(chǎn)生乳酸、氨基酸等有機(jī)酸，使得pH值迅速下降；18 h后pH值趨于穩(wěn)定，到24 h時(shí)培養(yǎng)液的pH值為3.3。說明2株乳酸菌均表現(xiàn)出良好的產(chǎn)酸能力，其24 h內(nèi)的pH值動(dòng)態(tài)變化與其生長曲線變化相符。

2.2菌株耐酸能力試驗(yàn)結(jié)果

食物通過胃液的時(shí)間一般為1～2 h，胃液的pH值變化對(duì)微生物的生長影響較大，且乳酸菌自身代謝產(chǎn)生的氨基酸、乳酸等有機(jī)酸也會(huì)改變其生長環(huán)境的pH值［10，17］。這就要求乳酸菌具有一定的耐酸能力。采用比濁法對(duì)2株乳酸菌SR6和SR10-1的耐酸能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖3所示。

圖3　菌株SR6（A）及SR10-1（B）在不同pH值和時(shí)間條件下的OD600nm值Fig.3 The OD600nmvalue of strain SR6（A）and SR10-1（B）atdifferent pH and time

由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值由6.5降至1.5時(shí)，同一菌株培養(yǎng)24 h后的OD600nm值逐漸減小，說明菌株的菌體濃度隨著pH值的降低而減小；當(dāng)pH值為3.5時(shí)，0～2 h內(nèi)，2株菌的OD600nm值無變化，4 h后開始緩慢升高，菌株的菌體濃度逐漸增大；當(dāng)pH值降至2.5后，菌株的OD600nm值幾乎無變化，菌株培養(yǎng)24 h的菌體濃度略有增長，增長幅度小，說明菌體細(xì)胞的生長受到一定抑制。菌株SR6的菌體濃度在各pH值條件下均有增長，其增長幅度隨pH值的降低而減小，在pH值低至1.5時(shí)仍有增長，但生長受到抑制；菌株SR10-1在pH值2.5、1.5時(shí)，菌株培養(yǎng)24 h后的菌體濃度略有增加，說明菌株的生長受到抑制或被殺死。有研究報(bào)道［18］，嗜酸乳桿菌在pH值1.0的PBS緩沖液中培養(yǎng)1 h后，仍能存活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩株乳酸菌在pH值為1.5的環(huán)境中仍有生長，均表現(xiàn)出良好的耐酸性。

2.3菌株耐滲透壓能力試驗(yàn)結(jié)果

微生物對(duì)滲透壓有一定的適應(yīng)能力，若滲透壓突然較大程度的升高或降低，會(huì)對(duì)微生物的生長有較大影響，甚至導(dǎo)致死亡。采用比濁法對(duì)2株乳酸菌SR6與SR10-1的耐滲透壓能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，2株乳酸菌SR6和SR10-1，在2%～8%NaCl條件下，菌體濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而增加；同一菌株培養(yǎng)24 h后的菌體濃度隨著NaCl含量的增大而逐漸減小。2株菌在8%NaCl含量下均可生長；在同一NaCl含量下，菌株SR6的OD600nm值較SR10-1高，表明SR6的耐滲透壓能力較SR10-1強(qiáng)。2菌株在8%NaCl環(huán)境中，0～8 h內(nèi)的OD600nm值無變化，說明其生長受到抑制。有研究表明［19-20］，乳酸菌可在含6%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中生長，有部分乳酸菌可以耐8%NaCl溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2株乳酸菌SR6和SR10-1均具有良好的耐滲透壓能力，其中菌株SR6的耐滲透壓能力優(yōu)于菌株SR10-1。

圖4　菌株SR6（A）及SR10-1（B）在不同NaCl含量和時(shí)間條件下的OD600nm值Fig.4 The OD600nmvalue of strain SR6（A）and SR10-1（B）at different NaCl content and time

2.4菌株耐亞硝酸鹽能力試驗(yàn)結(jié)果

乳酸菌常作為發(fā)酵劑被應(yīng)用于制作發(fā)酵肉制品、乳制品及酸菜、泡菜等。在制作酸菜和泡菜的過程中，蔬菜自身帶有的硝酸鹽在微生物的作用下被轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽；在低溫發(fā)酵肉制品加工過程中，常添加硝酸鹽和亞硝酸鹽作為發(fā)色劑和防腐劑。這就要求應(yīng)用的乳酸菌要具有一定的耐亞硝酸鹽能力。采用比濁法對(duì)2株乳酸菌SR6與SR10-1的耐亞硝酸鹽能力進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，2株乳酸菌SR6和SR10-1在0～0.04% NaNO2含量條件下均生長良好，同一菌株在各NaNO2含量下培養(yǎng)24 h后的OD600nm值幾乎無變化，表現(xiàn)出良好的耐亞硝酸鹽能力。有研究表明［21-22］，乳酸菌可降低食物中亞硝酸鹽的生成量或直接降解食物中的亞硝酸鹽；張慶芳等［23］對(duì)乳酸菌降解亞硝酸鹽的機(jī)理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對(duì)亞硝酸鹽的降解分為酶降解和酸降解2個(gè)階段，培養(yǎng)液pH值＞4.5時(shí)，以酶降解為主；培養(yǎng)液pH值＜4.0時(shí)，以酸降解為主。

圖5　菌株SR6（A）及SR10-1（B）在不同NaNO2含量和時(shí)間條件下的OD600nm值Fig.5 The OD600nmvalue of strain SR6（A）and SR10-1（B）at different NaNO2content and time

2.5人工模擬胃腸液試驗(yàn)結(jié)果

胃液具有強(qiáng)酸性，且含有胃蛋白酶等抑菌物質(zhì)，小腸內(nèi)含有胰蛋白酶等抑菌物質(zhì)［10，24］，因此，乳酸菌必須以活菌狀態(tài)通過胃液，并能耐受腸液的不良環(huán)境才能發(fā)揮其益生功能。食物通過胃的時(shí)間一般為1～2 h，通過小腸的時(shí)間一般為2～3 h［25］。對(duì)2株乳酸菌進(jìn)行人工模擬胃腸液耐受試驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。

表1　菌株在人工模擬胃腸液環(huán)境中的存活數(shù)與耐受率Table 1 Survival number and tolerace rate of strains in artificial gastrointestinal fluid

由表1可知，兩株菌在人工模擬消化液中的存活受到抑制，經(jīng)消化液處理3 h后，活菌數(shù)明顯下降，但兩株菌的活菌數(shù)均維持在5×107CFU/mL以上，高于臨界值106CFU/mL，其中菌株SR6的活菌數(shù)為（6.90±0.15）×107CFU/mL，菌株SR10-1的活菌數(shù)為（5.20±0.15）×107CFU/mL。經(jīng)過3 h人工模擬胃腸液處理后，菌株SR6對(duì)模擬胃腸液的耐受率為5.70%，菌株SR10-1對(duì)模擬胃腸液的耐受率為3.64%。結(jié)果顯示，2株乳酸菌在經(jīng)過3 h胃腸道處理后仍有大量菌體存活，對(duì)胃腸道逆境均表現(xiàn)出良好的抵抗力，可起到良好的益生作用。

3　結(jié)論

通過對(duì)彎曲乳桿菌LAB26與戊糖片球菌LAB42的耐受性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，2株乳酸菌不僅具有良好的生長性能，且對(duì)高酸度、高滲透壓、高亞硝酸鹽均表現(xiàn)出不同程度的耐受性。2菌株均可在高酸度環(huán)境下生長，且SR6在pH值為1.5的環(huán)境仍有生長，表現(xiàn)出較好的耐酸性；2菌株均可在高滲透壓環(huán)境下生長，且SR6在8%NaCl含量環(huán)境下生長良好，表現(xiàn)出較好的耐滲透壓能力；2菌株在0～0.04%NaNO2含量范圍內(nèi)均正常生長，且代謝活躍，表現(xiàn)出良好的亞硝酸鹽耐受能力；經(jīng)過人工胃腸液處理3 h后，2株菌在人工消化環(huán)境中具有良好的存活能力，活菌數(shù)均維持在5×107CFU/mL以上，可抵抗胃腸道逆境，表現(xiàn)出良好的耐受能力。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，菌株SR6的整體耐受能力優(yōu)于菌株SR10-1。

本研究采用的彎曲乳桿菌LAB26與戊糖片球菌LAB42均表現(xiàn)出良好的耐受性，且2株菌也符合作為乳酸菌發(fā)酵功能食品菌種耐受胃腸道環(huán)境的要求，具有進(jìn)一步研究應(yīng)用的價(jià)值，在開發(fā)乳酸菌發(fā)酵功能食品方面也具有應(yīng)用潛力。

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Tolerance property of two lactic acid bacteria isolated from fermented meat of Guizhou Dong and Miao

LOU Lijiao，HU Ping*，ZHAN Jianlong，ZHANG Yulong，F(xiàn)AN Min
（School of Liquor and Food Engineering，Gui Zhou University，Guiyang 550025，China）

Tolerance propertiesofLactobacillus curvatusLAB26（SR6）andPediococcus pentosaceusLAB42（SR10-1）from fermented meat of Guizhou Dongand Miao were researched.The results showed that two strains of lactic acid bacteria had good capacity，including acid-tolerance，NaCl-tolerance，NaNO2-tolerance and artificial gastrointestinal fluid tolerance and they could grow well at pH 3.5.The strain SR6 could still grow at pH 1.5 and it had good acid-tolerance capacity.The both strains could grow well at the conditions of 8%NaCl and the metabolism was active and theycan grow normally at the conditions of 0-0.04%NaNO2.The viable count of two strains in artificial gastrointestinal fluid after 3 h was both more than 5.0×107CFU/ml. The study indicated thatL.curvatusLAB26 andP.pentosaceusLAB42 both had good tolerance properties，and could be used for the development of functional foods.

fermented meat；Lactobacillus curvatus；Pediococcus pentosaceus；lactic acid bacteria；tolerance property

TS261.9

A

0254-5071（2015）11-0126-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.029

2015-10-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260379）

婁利嬌（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。

胡萍（1970-），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。