米醋廢渣發(fā)酵紅曲色素的條件研究

杜甫軍1，胡偉蓮2，馮緯1，戴德慧2
（1.杭州食品釀造有限公司，浙江杭州310017；2.浙江科技學(xué)院，浙江杭州310023）

對米醋廢渣主要成分進(jìn)行了分析，其中干燥質(zhì)量損失為66.89%，酒精度為4.15%vol，干物質(zhì)中粗蛋白、粗淀粉、粗纖維、粗脂肪含量分別為63.83%、7.55%、10.77%、9.02%。以米醋廢渣為發(fā)酵培養(yǎng)基對8株紅曲霉進(jìn)行了篩選，得到一株紅曲色素產(chǎn)量較高的紅曲霉MS-5，其色素合成周期顯著短于同條件下的大米培養(yǎng)基。通過單因素及正交試驗(yàn)對米醋廢渣紅曲色素發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，最佳工藝參數(shù)為葡萄糖添加量5%，氯化銨添加量1.5%，初始水含量50%，初始pH值6.0，發(fā)酵時間6 d。在此條件下紅曲色素發(fā)酵產(chǎn)量可達(dá)（1 252.5±47）U/g。

米醋廢渣；紅曲色素；固態(tài)發(fā)酵；優(yōu)化

紅曲色素是由紅曲霉屬（Monascus）的絲狀真菌在生長代謝過程中合成的次級代謝產(chǎn)物，與其他天然色素相比，具有安全性高、色澤鮮紅、著色力強(qiáng)、穩(wěn)定性好、口味自然及pH適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)［1-2］。此外，研究還發(fā)現(xiàn)紅曲色素具有降低血脂、降血壓、防腐保鮮等生理活性。因此紅曲色素具有天然、營養(yǎng)、多功能等多重特點(diǎn)［3-4］，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及化工等行業(yè)中。

目前紅曲色素的生產(chǎn)方法主要有固態(tài)和液態(tài)發(fā)酵兩種。液態(tài)發(fā)酵雖然自動化程度高，生產(chǎn)周期短，但其色素產(chǎn)量較低，耗水量大，發(fā)酵后有大量的廢水需要處理。而固態(tài)發(fā)酵具有生產(chǎn)節(jié)水、提取成本低、操作簡單、不會造成二次污染等優(yōu)點(diǎn)［5］，因此，紅曲色素的工業(yè)化生產(chǎn)仍以大米為原料進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)為主。但由于耗糧高，不利于紅曲色素產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。在現(xiàn)代大型米醋釀造企業(yè)，其排放的米醋廢渣是大米經(jīng)過糖化、酒精發(fā)酵后，醋酸發(fā)酵前發(fā)酵液壓榨后排放的殘渣，有大量可利用營養(yǎng)成分。目前，大部分殘渣只是簡單的干燥后被當(dāng)作廉價的飼料出售，經(jīng)濟(jì)效益不太明顯。利用食醋廢渣發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素少見文獻(xiàn)報道。本研究對米醋廢渣替代大米生產(chǎn)紅曲色素進(jìn)行了初步探討，為米醋廢渣再生利用，降低紅曲色素生產(chǎn)成本開辟新的途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紅曲霉MS-1、MS-2、MS-3、MS-4、MS-5、MS-6、MS-7、MS-8：由杭州食品釀造有限公司研發(fā)中心收集并保藏。

新鮮米醋廢渣：杭州食品釀造有限公司。

斜面培養(yǎng)基：麥芽浸粉2.0%，蛋白胨0.5%，瓊脂2.0%，pH自然。

液體種子培養(yǎng)基：麥芽浸粉2.0%，蛋白胨0.5%，pH自然。

米醋廢渣培養(yǎng)基：米醋廢渣取30 g裝入300 mL三角瓶內(nèi)，八層紗布封口，121℃滅菌30 min。

傳統(tǒng)大米培養(yǎng)基：大米30 g，pH 4.0的乳酸水浸泡20 h后瀝干水分，含水量50%左右，裝入300 mL三角瓶中，八層紗布封口，121℃滅菌30 min。

1.2儀器與設(shè)備

BS224S型電子天平：北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司；BL-50A型高壓蒸汽滅菌鍋、MJX-250B-Z型霉菌培養(yǎng)箱、GZX-9140MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1B型凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV5100分光光度計：上海元析儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1米醋廢渣中主要成分分析

對深層液態(tài)發(fā)酵米醋新鮮廢渣連續(xù)采樣3批，對其干燥質(zhì)量損失、粗蛋白、粗淀粉、酒精度、粗纖維素含量等理化指標(biāo)進(jìn)行測定分析。

1.3.2菌種活化

取活化后的斜面菌種一支，用無菌水將孢子洗下。接種于液體種子培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)4 d后，按接種量的5%接入米醋廢渣培養(yǎng)基中。

1.3.3紅曲色素合成菌株篩選

將收集的8株紅曲霉分別制成液體種子后接入米醋廢渣固體培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)6 d，測定紅曲色素含量，比較各菌株色素合成能力，選出色素合成能力最強(qiáng)的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.4培養(yǎng)時間對紅曲色素合成的影響

將紅曲霉MS-5的液體種子分別接入傳統(tǒng)大米培養(yǎng)基及米醋廢渣培養(yǎng)基中，32℃培養(yǎng)9 d，每隔24 h測定一次紅曲色素含量。

1.3.5單因素及正交試驗(yàn)

以米醋廢渣發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，考察了不同種類及含量的碳源、氮源、初始水分含量、初始pH值等培養(yǎng)基條件對紅曲色素的合成影響。并在此基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖添加量、氯化銨添加量、初始水分含量、初始pH值4個因素，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)優(yōu)化。

1.3.6測定方法

粗蛋白的測定：GB 50095—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》［6］；粗脂肪的測定：GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測定》［7］；干燥質(zhì)量損失參照含水量的測定：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》［8］；粗纖維的測定：GB/T5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》［9］；粗淀粉的測定：GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的測定》［10］；紅曲色素的測定：GB 4926—2008《食品添加劑紅曲米（粉）》［11］；酒精度的測定參照文獻(xiàn)［12］。

2　結(jié)果與分析

2.1米醋廢渣中主要成分分析

對新鮮米醋廢渣中的干燥質(zhì)量損失、粗纖維、粗脂肪、粗蛋白、粗淀粉、酒精等理化進(jìn)行了測定，其結(jié)果見表1。

表1　米醋廢渣中主要成分及含量Table 1 Main components and contents of vinegar wastes

現(xiàn)代制醋企業(yè)為了適應(yīng)大型自吸式發(fā)酵罐的溶氧需要，酒精發(fā)酵后即壓濾排出廢渣，清液進(jìn)行醋酸發(fā)酵。從表1米醋廢渣的理化分析可以看出，大米經(jīng)過糖化、酒精發(fā)酵后廢渣中粗淀粉的含量較少。而大米中蛋白質(zhì)未被利用，殘留在廢渣中，同時酒精發(fā)酵后大量酵母細(xì)胞殘留。紅曲霉中含有較高酶活力的淀粉酶和蛋白，同時能耐受較高的酒精度。因此，米醋廢渣可以作紅曲霉的培養(yǎng)基質(zhì)，發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素具有一定的可行性。

2.2紅曲色素合成菌株篩選

將試驗(yàn)室保藏的8株菌株進(jìn)行了產(chǎn)紅曲色素能力的篩選，其結(jié)果見圖1。

圖1　不同紅曲霉菌株紅曲色素的產(chǎn)量Fig.1 Monascus pigments production of different strains

由圖1所示，在米醋廢渣培養(yǎng)基中，不同菌株產(chǎn)紅曲色素的能力各不相同，其中MS-5菌株色素合成能力最高，在米渣培養(yǎng)基中生長良好，色素合成均勻。因此，以MS-5為發(fā)酵菌株進(jìn)行下一步研究。

2.3培養(yǎng)時間對紅曲色素產(chǎn)量的影響

以傳統(tǒng)的大米培養(yǎng)基為對照，考察了培養(yǎng)時間對紅曲霉MS-5對紅曲色素合成的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在大米培養(yǎng)基中紅曲色素最高產(chǎn)量高于米醋廢渣培養(yǎng)基，但在米醋廢渣培養(yǎng)基中色素合成速度較快，培養(yǎng)2～3 d顏色就有明顯變化，6 d紅曲色素產(chǎn)量達(dá)到最高，在大米培養(yǎng)基中，8 d才達(dá)到高峰。這可能與兩者培養(yǎng)基中碳氮比差異較大有關(guān)，大米培養(yǎng)基中淀粉含量較高，碳氮比高，有利于菌體生長，推遲了次生代謝產(chǎn)物紅曲色素的合成。因此，米醋廢渣培養(yǎng)基合成紅曲色素的周期較大米培養(yǎng)基短。

圖2　培養(yǎng)時間對紅曲色素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of culture time on Monascus pigments production

2.4碳源種類及添加量對紅曲色素產(chǎn)量的影響

米醋廢渣經(jīng)過糖化、酒精發(fā)酵、壓榨去清液后，碳源含量相對較低［13］，為了提高紅曲色素的產(chǎn)量，在米醋廢渣培養(yǎng)基中添加不同含量的葡萄糖、蔗糖、淀粉等常用碳源，接種紅曲霉進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，32℃培養(yǎng)6 d后，測定紅曲色素產(chǎn)量，結(jié)果見圖3。

圖3　碳源種類及添加量對紅曲色素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of carbon sources type and addition on Monascus pigments production

由圖3可知，在米醋廢渣培養(yǎng)基中添加部分碳源，能明顯提高紅曲色素的產(chǎn)量，且碳源種類對紅曲色素合成也有較大的差異，葡萄糖為添加碳源時明顯優(yōu)于淀粉與蔗糖。其添加比例為4%時紅曲色素產(chǎn)量最高。因此，選擇葡萄糖添加量4%為宜。

2.5氮源種類及添加量對紅曲色素產(chǎn)量的影響

氮源是微生物菌體成分及紅曲色素的重要組成部分，米醋廢渣中雖含量大量的大米蛋白，但屬于遲效氮源，需要在蛋白酶的作用下水解為氨基酸后才能被菌體利用。由于紅曲霉蛋白酶合成較少且剛接種時菌絲體量少，淀粉酶活力偏低，可能會影響紅曲霉生長及色素合成?？疾炝颂砑油庠此傩У磳t曲色素合成的影響，在米醋廢渣培養(yǎng)基中添加了不同含量的蛋白胨、氯化銨、尿素進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，其結(jié)果見圖4。

圖4　氮源種類及添加量對紅曲色素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of nitrogen source types and addition on Monascus pigments production

由圖4可知，不同外加氮源的種類及含量對紅曲色素合成影響較大，添加有機(jī)氮源蛋白胨，對紅曲色素的合成有一定的促進(jìn)作用，但差異不大。添加有機(jī)氮源尿素對紅曲色素的合成有一定的抑制作用?？赡苁羌t曲霉對尿素耐受性低，其菌絲的生長受到了明顯的影響。添加無機(jī)氮源氯化銨能有效提高紅曲色素的產(chǎn)量，最佳添加量為1.5%。這可能是氯化銨能快速的被紅曲霉利用，促進(jìn)了菌體的生長，為次生代謝產(chǎn)物紅曲色素的合成提供了充足的前體，從而有利于紅曲色素的合成。這與文獻(xiàn)報道一致［14］。2.6基質(zhì)初始含水分含量對紅曲色素產(chǎn)量的影響

基質(zhì)初始含水量分別控制在30%、40%、50%、60%、70%，接種紅曲霉進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后，測定紅曲色素含量，其結(jié)果見圖5。

圖5　初始水分含量對紅曲色素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of original moisture content on Monascus pigments production

由圖5可知，隨著基質(zhì)初始水分含量增加，紅曲色素含量不斷增加，但初始水分含量＞50%以后，紅曲色素的含量開始顯著下降。這可能是因?yàn)槌跏妓趾窟^低其培養(yǎng)基膨脹程度低，同時培養(yǎng)過程中水分蒸發(fā)造成基質(zhì)物料干燥，從而影響紅曲霉的生長及紅曲色素合成。但水分含量過高，基質(zhì)易黏結(jié)且有黏液產(chǎn)生，降低了基質(zhì)多孔性，減少了基質(zhì)內(nèi)氣體的體積和氣體交換，不利于通風(fēng)降溫，影響了紅曲霉的生長及色素的合成［15］。因此，選擇初始水分含量為50%。

2.7基質(zhì)初始pH值對紅曲色素產(chǎn)量的影響

紅曲霉在偏酸性環(huán)境下生長較好，較高的pH值條件下在培養(yǎng)過程較易染菌。因此，考察了基質(zhì)初始pH在3～7范圍內(nèi)對紅曲色素合成的影響，其結(jié)果見圖6。

圖6　初始pH對紅曲色素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of original pH on Monascus pigments production

由圖6可知，紅曲霉在初始pH 3～7范圍內(nèi)均能生長并產(chǎn)生紅曲色素，初始pH＜6.0時，紅曲色素產(chǎn)量隨著pH增加而增加，但pH＞6.0后紅曲色素的產(chǎn)量發(fā)生明顯的下降。因此，過高和過低的pH均不利于紅曲色素的合成，最佳的初始pH值選擇為6.0。

2.8正交試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基條件對紅曲色素合成的影響

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖添加量、氯化銨添加量、初始水分含量、初始pH值為4個因素，每個因素選擇3個水平，以紅曲色素產(chǎn)量為考察指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)。

表2　培養(yǎng)條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for culture conditions optimization

由表2可知，對紅曲色素合成影響因素大小依次為葡萄糖添加量＞初始水分含量＞初始pH值＞氯化銨添加量。這反映出葡萄糖的添加量及初始水分含量是影響紅曲色素合成的重要條件，在基質(zhì)中適當(dāng)?shù)奶砑悠咸烟羌熬S持合適的水分含量可以大幅度提高紅曲色素的合成。綜合以上分析，最佳培養(yǎng)條件為葡萄糖添加量為5%，氯化銨添加量為1.5%，初始水分含量為50%，初始pH值為6.0。在該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。其紅曲色素產(chǎn)量可達(dá)（1 252.5±47）U/g。表明通過正交優(yōu)化能顯著提高紅曲色素的合成。

3　結(jié)論

利用米醋廢渣替代大米固態(tài)發(fā)酵紅曲色素具有一定的可行性，收集紅曲霉中MS-5菌株在米醋廢渣培養(yǎng)基中表現(xiàn)較高的色素合成能力，色素合成周期短于大米培養(yǎng)基。

通過一系列單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化了米醋廢渣紅曲色素發(fā)酵工藝，最佳工藝為葡萄糖添加量5%，氯化銨添加量1.5%，初始水分含量50%，初始pH值6，發(fā)酵時間6 d。此條件下紅曲色素產(chǎn)量可達(dá)（1 252.5±47）U/g。

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［7］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB/T 14772—2008食品中粗脂肪的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［8］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 5009.3—2010食品中水分的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

［9］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.10—2003植物類食品中粗纖維的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［10］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB/T 5009.9—2008食品中淀粉的測定［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［11］中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.GB 4926—2008食品添加劑紅曲米（粉）［S］.北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［12］岳元媛，向文良，張文學(xué)，等.白酒發(fā)酵糟酷中殘余酒精含量檢測方法的探討［J］.中國釀造，2005，24（7）：55-57.

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［15］劉穎.紅曲色素的固態(tài)發(fā)酵法制取技術(shù)及其穩(wěn)定性研究［D］.長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2006.

Fermentation conditions of Monascus pigments with vinegar wastes

DU Fujun1，HU Weilian2，F(xiàn)ENG Wei1，DAI Dehui2
（1.Hangzhou Food Brewing Co.，Ltd.，Hangzhou 310017，China；2.Zhejiang University of Science and Technology，Hangzhou 310023，China）

The main components of vinegar wastes were analyzed.The results showed that loss on drying，alcohol content，crude protein，crude starch，crude fiber，crude fat were 66.89%，4.15%vol，63.83%，7.55%，10.77%and 9.02%，respectively.Using vinegar wastes as fermentation medium，a strain namedMonascussp.MS-5 with high-yield Monascus pigments was screened from eight strains，and the pigments synthesizing cycle reduced significantlycompared with the rice medium in the same condition.The optimal fermentation conditions of vinegar waste Monascus pigments were optimized by single factor and orthogonal experiments.Results indicated that the optimal technology parameters were glucose 5%，ammonium chloride 1.5%，original moisture content 50%，original pH 6.0 and fermentation time 6 d.The yield of Monascus pigments reached up to（1 252.5±47）U/g at the optimal condition.

vinegar wastes；Monascus pigments；solid state fermentation；optimization

Q93-331

A

0254-5071（2015）11-0071-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.016

2015-10-11

浙江省科技計劃項(xiàng)目（2014C33039）

杜甫軍（1968-），男，工程師，本科，主要從事釀造行業(yè)的科研與生產(chǎn)工作。