羅文俊

【摘 要】在高中生物教學(xué)中，胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)試驗是一項重要的試驗教學(xué)，對胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)試驗進行研究和改進十分有必要。因此，本文對胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)試驗進行探討和分析，希望為相關(guān)人士提供有價值的參考，促進胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)試驗的不斷進步，不斷完善。

【關(guān)鍵詞】胡蘿卜；愈傷組織培養(yǎng)；試驗

1.植物組織培養(yǎng)研究及與高中生物學(xué)科的聯(lián)系

在生物學(xué)科重新進入高考以來，與植物組織培養(yǎng)息息相關(guān)的知識點如：細胞全能性、植物的激素調(diào)節(jié)、及植物組織培養(yǎng)技術(shù)歷年來都被列入高考大綱和考試說明，故在高中建立組培實驗室并開展組培實驗?zāi)転楝F(xiàn)階段高中生物教學(xué)，尤其是實驗教學(xué)提供第一手的可靠數(shù)據(jù)資料，對現(xiàn)階段高中生物教研來說是十分必要的。

1.1植物組織培養(yǎng)的定義

植物組織培養(yǎng)是指在無菌的條件下，將離體的植物器官、組織、細胞以及原生質(zhì)體，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適當?shù)呐囵B(yǎng)條件，使其長成完整的植株。由于培養(yǎng)物是脫離植物母體，在玻璃瓶中進行培養(yǎng)，所以也叫做離體培養(yǎng)。其完整過程是：

2.胡蘿卜組織培養(yǎng)技術(shù)

2.1胡蘿卜組織培養(yǎng)實驗流程

MS母液配制→培養(yǎng)基配制及滅菌→愈傷組織誘導(dǎo)→遇上組織繼代培養(yǎng)→觀察記錄

2.2胡籮卜組織培養(yǎng)實驗用品

新鮮的胡籮卜莖段，超凈工作臺、高壓蒸汽滅菌鍋、電子天平、電熱爐、恒溫箱、pH值測試器、紫光燈、鑷子、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、濾紙、吸水紙、封口膜、MS固體培養(yǎng)基、Na2S2O3、1mol/LNaOH、2mg/L2，4-D溶液，1mg/L6-BA溶液、0.5mg/ml NAA溶液、15%鹽酸、3%次氯酸鈉、無水乙醇、0.1%升汞、蒸餾水。

2.3胡籮卜組織培養(yǎng)實驗準備工作

2.3.1母液配制

MS母液培養(yǎng)基配制：去植物組織培養(yǎng)MS固體培養(yǎng)基并加蒸餾水稀釋配置母液

植物激素配置：2，4-D：2mg/L、6-BA：1mg/L

注：2，4-D和NAA可先用酒精溶解在加蒸餾水定容，6-BA用濃鹽酸溶解后加蒸餾水定容。

2.3.2誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制和滅菌

MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.1mg 6-BA+2mg 2，4-D

配制體積500ml，分裝為12瓶

取蒸餾水加入規(guī)定量的母液，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和Na2S2O3，定容并檢測pH值并調(diào)節(jié)pH值為5.0左右。

注：在課本中要求的pH值為5.8—6.0，但是在具體的實驗過程中發(fā)現(xiàn)當pH值在該數(shù)值左右時外植體的褐話現(xiàn)象較為嚴重，故將pH值調(diào)低至4.5-5.0。培養(yǎng)基置于高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌，滅菌后培養(yǎng)基在黑暗中放置3——5天觀察是否有微生物污染。

2.3.3其他所需滅菌物品：

培養(yǎng)皿，三角燒瓶，若干濾紙，無菌水，若干吸水紙，解剖刀柄，剪刀，鑷子等。

2.4胡籮卜組織培養(yǎng)方法

①用75%乙醇將凈化工作臺擦洗干凈，將接種所用的、工具、培養(yǎng)基等準備好放入工作臺。打開紫外燈和風(fēng)機至少20分鐘后開始操作。

關(guān)閉紫外燈，點燃酒精燈。

②取胡籮卜一只，沖洗20分鐘，切取形成層部分約1cm3的塊狀，操作者手應(yīng)用酒精消毒，在無菌操作臺上將胡籮卜段用酒精溶液消毒30秒，并立即用無菌水清洗2至3次，在用氯化汞溶液處理10——15分鐘，并立即用無菌水反復(fù)清洗2至3次。

③取一無菌培養(yǎng)基三角瓶：將消毒后的胡籮卜組織放入三角瓶中，每瓶3—5個，接10瓶，用封口膜封口，并用記號筆寫上接種日期。

④接種后的三角瓶置于培養(yǎng)室，20——25℃條件下，黑暗培養(yǎng)2-3周，直至愈傷組織形成。

2.4.1外植體褐變：

在具體的實驗過程中發(fā)現(xiàn)外植體的褐變現(xiàn)象較為嚴重，造成外植體死亡。其原因是由于在切割外植體時切割部位的細胞受傷使得植物體內(nèi)處于分離狀態(tài)的酚類化合物與多酚氧化酶相遇，酚類化合物在多酚氧化酶的作用下形成醌類化合物和水，導(dǎo)致植物體其他酶系統(tǒng)失活，進而導(dǎo)致代謝系統(tǒng)紊亂，最終死亡。為了解決這一問題，在實驗中，我們盡量選取了幼年的植物，并在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑Na2S2O3作為防褐劑。同時，在酸性和低溫環(huán)境不利于醌類化合物的產(chǎn)生，故將pH值調(diào)低至4.5—5.0，溫度調(diào)低至20oC。另外光照環(huán)境也有利于醌類物質(zhì)的形成，故將接種后的培養(yǎng)基置于無光條件下培養(yǎng)。

注意事項：

1.所有的組織培養(yǎng)實驗操作都必須在無菌條件下進行，所以我們必須時時注意實驗材料的無菌和消毒，實驗用具必須經(jīng)過嚴格的滅菌，在滅菌的時候要特別注意必需等到燒熱的實驗儀器冷卻后再接觸材料，否則會把材料“燙傷”，所有的轉(zhuǎn)移材料的操作必須在無菌操作臺上進行。

2.接種時，動作要輕，力度適中。不要把接種的切塊壓入培養(yǎng)基里面，以致破壞培養(yǎng)基。同時要注意接種時瓶口應(yīng)傾斜45度并在酒精燈火焰附近，以免手、鑷子上的贓物容易掉到三角瓶里。

3.培養(yǎng)基消毒滅菌時間不宜過長，也不可超過滅菌鍋規(guī)定的壓力范圍；當滅菌完成后，應(yīng)切斷電源，待鍋內(nèi)氣壓接近“0”時，方可打開放氣閥，取出培養(yǎng)基。

4.配制培養(yǎng)基時，要按照規(guī)定的用量認真計算并嚴格取出相應(yīng)的母液。

【參考文獻】

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（作者單位：青海省油田第一中學(xué)）