周　瑩，劉華鋼，蘇桂玉，彭曉麗

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧　530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧　530001）

二去水衛(wèi)矛醇對人卵巢癌細胞的體外抑制作用

周瑩1，劉華鋼1，蘇桂玉2，彭曉麗2

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧530022；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001）

［目的］研究二去水衛(wèi)矛醇（1，2：5，6-dianhydroga-lactitol，DAG）對人卵巢癌細胞A2780和SKOV3增殖的抑制作用。［方法］采用噻唑藍（MTT）比色法和CCK-8（cell counting kit-8）法檢測不同濃度DAG對人卵巢癌細胞A2780和SKOV3的體外抑制作用，觀察DAG的半數(shù)抑制濃度。［結(jié)果］MTT法檢測結(jié)果顯示，DAG對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3作用72 h后半數(shù)抑制濃度（72 h-IC50）分別為19.97 μg/ml、22.57 μg/ml；而CCK-8法檢測結(jié)果顯示，DAG對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3作用72 h后72 h-IC50分別為15.15 μg/ml、16.15 μg/ml。顯微鏡下可見DAG 72 h作用后細胞圓縮、胞質(zhì)濃縮、胞漿內(nèi)顆粒集中邊緣化甚至細胞溶解等損傷現(xiàn)象。［結(jié)論］DAG在體外對人卵巢癌細胞A2780和SKOV3均有抑制生長作用。

二去水衛(wèi)矛醇；人卵巢癌細胞；噻唑藍試驗；CCK-8法；半數(shù)抑制濃度

二去水衛(wèi)矛醇（1，2:5，6-dianhydroga-lactitol，DAG）是以從衛(wèi)矛科植物蜜花美登木（Maytenus confertiflorus J.Y.Lao ex X.X.Chen）中分離出的衛(wèi)矛醇［1］（dulcitol）為原料，經(jīng)溴化、消除反應(yīng)而制得的1，6-二溴衛(wèi)矛醇（1，6-dibromidulcitol）的雙環(huán)氧化物，是新型的植物生物堿類抗腫瘤藥，它與烷化劑形成交叉耐藥，結(jié)構(gòu)上可歸為烷化劑類，為廣譜抗腫瘤藥物，具有毒性小、易溶于水、抗腫瘤活性高等優(yōu)點。早期臨床試驗表明，DAG對慢性粒細胞白血病、肺癌、原發(fā)性腦瘤、人胃癌細胞、人鼻咽癌細胞、人肺癌細胞、腎上腺腫瘤、膀胱癌、胃腸道腫瘤實體瘤等均有抑制作用［2-7］。另外，還有研究表明DAG是周期非特異性藥物，它可以與某些周期特異性藥產(chǎn)生協(xié)同作用［8］。而DAG對人卵巢癌抑制作用及分子機制的研究在國內(nèi)外尚未見詳盡報道。為此，本實驗通過噻唑藍（MTT）比色法和CCK-8法檢測DAG對人卵巢癌的體外抗腫瘤活性，為擴大其抗瘤譜及進一步進行結(jié)構(gòu)改造、分子機制研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1藥物與細胞株二去水衛(wèi)矛醇由廣西梧州制藥（集團）股份有限公司提供，臨用前用完全培養(yǎng)基液配成所需濃度；RPMI 1640、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶溶液均購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L）是福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；青鏈霉素混合液（100 U/ml）和噻唑藍（MTT）均是北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；CCK-8溶液是上海尚寶科技有限公司產(chǎn)品；人卵巢癌細胞A2780和SKOV3購自中科院上海細胞庫。

1.2主要儀器設(shè)備CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher scientific，USA）；酶標儀（Tecan Austria GmbH）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠出品）。

1.3細胞的培養(yǎng)先配好含10%胎牛血清和青鏈霉素混合液（終濃度為青霉素100 IU/ml，鏈霉素100 μg/ml）的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，然后用此完全培養(yǎng)液于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人卵巢癌細胞A2780和SKOV3，細胞貼壁生長，隔天換液，待細胞長至覆蓋瓶底的80%左右時，用0.25%胰蛋白酶溶液消化傳代。取狀態(tài)良好的長至對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)細胞增殖抑制實驗。

1.4MTT試驗方法收集對數(shù)生長期的A2780和SKOV3細胞，調(diào)整細胞密度，以每孔100 μl、5×103個細胞接種于96孔板里，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以細胞培養(yǎng)基為空白對照，A2780、SKOV3細胞的其他組分別加入6 μg/ml、12 μg/ml、24 μg/ml、48 μg/ml、96 μg/ml DAG完全培養(yǎng)液100 μl，同時每組設(shè)5個復(fù)孔，處理完后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，并于每孔中加入20 μl的MTT溶液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO溶液顯色，振蕩10 min，使孔內(nèi)溶液顏色均勻，于570 nm波長酶標儀測定吸光度值（OD）。實驗重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。按下式計算細胞增殖抑制率:

細胞增殖抑制率=1-實驗組平均OD值/空白對照組平均OD值×100%，計算細胞生長抑制達50%的DAG濃度，以72 h-IC50表示。

1.5CCK-8試驗方法細胞處理情況與MTT法相似，待培養(yǎng)細胞，給藥處理72 h后，同樣于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，將每孔培養(yǎng)液混合均勻，吸出100 μl棄去，并于每孔中加入10 μl的CCK-8溶液，放入CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待1.5 h后觀察顯色情況，于450 nm波長酶標儀測定吸光度值（OD）。實驗重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果，計算細胞增殖抑制率。

2　結(jié)果與分析

2.1兩種方法測定結(jié)果MTT法測定不同濃度DAG對A2780及SKOV3細胞作用72 h后的OD值及細胞增殖抑制率見表1，CCK-8法測定不同濃度DAG對A2780及SKOV3細胞作用72 h后的OD值及細胞增殖抑制率見表2。通過SPSS19.0軟件計算DAG對兩種細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。表1、表2結(jié)果看出，經(jīng)不同濃度DAG作用72 h后，上述實驗組的OD值與空白對照組相比均呈下降趨勢，且有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。說明DAG對以上兩株人卵巢癌細胞均有抑制生長作用。兩種測定方法的結(jié)果顯示，CCK-8法的靈敏度和準確度較高，且重復(fù)性優(yōu)于MTT法。

表1　MTT法測定不同DAG濃度對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3細胞增殖的影響?。ā纒，n=5）

表1　MTT法測定不同DAG濃度對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3細胞增殖的影響?。ā纒，n=5）

DAG （μg/ml）A2780 OD　抑制率（%）SKOV3 （μg/ml）　OD　抑制率（%）72 h-IC5072 h-IC50（μg/ml）0 1.35±0.02　0.00　1.60±0.04　0.00 1.02±0.03　0.24　1.23±0.03　0.23 12　0.89±0.04　0.34　19.97　1.19±0.02　0.26　22.57 24　0.65±0.03　0.51　0.94±0.02　0.41 48　0.24±0.03　0.82　0.50±0.03　0.69 96　0.01±0.01　0.99　0.09±0.02　0.94 6

表2　CCK-8法測定不同DAG濃度對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3細胞增殖的影響?。ā纒，n=5）

表2　CCK-8法測定不同DAG濃度對人卵巢癌細胞A2780、SKOV3細胞增殖的影響?。ā纒，n=5）

A2780　SKOV3 DAG （μg/ml）OD　抑制率（%）72 h-IC50（μg/ml）OD （μg/ml）抑制率（%）72 h-IC50（μg/ml）0 0.88±0.01　0.00　1.09±0.01　0.00 0.66±0.01　0.25　0.85±0.00　0.22 12　0.46±0.02　0.47　15.15　0.64±0.01　0.41　16.15 24　0.25±0.01　0.71　0.40±0.01　0.63 48　0.12±0.02　0.86　0.20±0.02　0.81 96　0.03±0.01　0.96　0.12±0.01　0.89 6

2.2細胞形態(tài)觀察結(jié)果DAG作用于A2780和SKOV3細胞72 h后，在倒置顯微鏡下觀察，各實驗組細胞均不同程度出現(xiàn)貼壁能力減弱、細胞圓縮、胞質(zhì)濃縮、胞漿內(nèi)顆粒集中邊緣化甚至細胞溶解等損傷現(xiàn)象，而空白對照組細胞均生長良好，細胞形態(tài)完整，胞質(zhì)透亮。

3　結(jié)論

本文初步探討了DAG對人卵巢癌細胞的體外抑制作用，結(jié)果表明，DAG對A2780、SKOV3兩株人卵巢癌細胞均有抑制生長作用，且具有明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。但DAG誘導(dǎo)人卵巢癌細胞凋亡所發(fā)生的基因、蛋白表達譜變化，體內(nèi)抑制人卵巢癌效果等有待于下一步深入研究，以便于發(fā)現(xiàn)新的作用靶點，對其進行相應(yīng)的結(jié)構(gòu)改造，開發(fā)抗腫瘤靶向制劑。

［1］Shirota O，Morita H，Takeya K，et al.Isolation of antitumor substance，dulcitol，from Maytenus eben lia［J］.Natural Medicines，1998，52（2）:184-186.

［2］樊亦軍，韋煥營，邢邦華，等.1，2:5，6-二去水衛(wèi)矛醇抗腫瘤作用及毒性［J］.華西藥學(xué)雜志，1987，2（3）:161-165.

［3］Lin B J，Tao R F.New druds of dianhydrogalactitol to chronic granulocyte leukemia［J］.New Medicine，1980，11 （12）:619-620.

［4］Eagan R T，Ingle J N，F(xiàn)rytak S，et al.Platinum-based polychenmotherapy versus dianhydrogalactitol in advanced nonsmall cell lung cancer［J］.Cancer Treat Rep，1977，61（7）: 1339-1345.

［5］Robert T，Eagan，Edward T，et al.PhaseII Studies of dianhydrogalactitol-based combination chemotherapy for recurrent brain tumors［J］.Oncology，1981，38（1）:4-6.

［6］Zhang H L，Wang J N，Liang S，et al.Inhibition effect of 1，2:5，6-dianhydrogalctitol on four different kinds of tumor cells in vitro［J］.Guangxi Scienses，2013，20（1）:82-84.

［7］曹林枝，滕少康，廖志紅，等.雙脫水二乙酰衛(wèi)矛醇對3種肝癌細胞生長的影響［J］.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，24 （4）:572-574.

［8］Fan Y J，Zhou J，Li M，et al.Experimental study of 1，2: 5，6-dianhydrogalactitol and maytenus on combinations［J］. Acta Pharmaceutica Sinica，1983，18（9）:648-652.

（編輯陳明偉）

R285.5

A

2095-4441（2015）04-0066-02

2015-10-22