申婷婷，古　聯(lián)，陳　清，梁寶云，嚴(yán)　雁

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧　530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧　530023）

臨床報(bào)道

GWAS識(shí)別的rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的關(guān)聯(lián)研究

申婷婷1，古聯(lián)2，陳清2，梁寶云2，嚴(yán)雁2

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧530023）

［目的］探索rs2107595多態(tài)性與中國南方漢族人缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的發(fā)生及血脂水平的關(guān)聯(lián)。［方法］選取缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證患者284例、對(duì)照組605例，采用Sequenom基因分型技術(shù)對(duì)rs2107595多態(tài)性進(jìn)行基因分型，運(yùn)用PLINK統(tǒng)計(jì)軟件分析基因型與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的發(fā)生及其血脂水平間的遺傳關(guān)聯(lián)。［結(jié)果］rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的發(fā)生無顯著關(guān)聯(lián)（均P＞0.05），而與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證患者血清總膽固醇的關(guān)聯(lián)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（加性模型：P=0.035）。［結(jié)論］GWAS識(shí)別的遺傳變異rs2107595多態(tài)性可能影響缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證患者的血脂代謝。

rs2107595；缺血性中風(fēng)；氣虛血瘀證；血清血脂水平

缺血性中風(fēng)病性為本虛標(biāo)實(shí)，其病因復(fù)雜，有風(fēng)、火、痰、瘀、氣、虛之分?，F(xiàn)代遺傳學(xué)研究證實(shí)了遺傳因素對(duì)缺血性中風(fēng)的發(fā)生具有重要作用［1］。2012年，Traylor等［2］的全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）報(bào)道了rs2107595多態(tài)性與歐洲人大動(dòng)脈粥樣硬化型腦卒中的發(fā)生關(guān)聯(lián)達(dá)到GWAS顯著水平（P＜1× 10-8）。2014年，另一項(xiàng)跨疾病GWAS研究［3］也報(bào)道了歐洲人群中rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)的易感性顯著關(guān)聯(lián)，表明rs2107595多態(tài)性可能影響缺血性中風(fēng)的發(fā)生。本研究旨在探討GWAS識(shí)別的rs2107595多態(tài)性與中國南方漢族人缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的發(fā)生及其血脂水平的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象觀察組284例缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證患者來自于2009年7月～2014年6月廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的住院患者，其中男142例，女142例，年齡66.99±10.45歲；對(duì)照組來源于同時(shí)期本院體檢中心的健康體檢者、骨科患非神經(jīng)系統(tǒng)疾病且病情輕微者共605例，其中男327例，女278例，年齡65.56±12.45歲。觀察組與對(duì)照組在性別、年齡分布方面均無顯著性差異（P＞0.05），具有可比性。所有納入對(duì)象均自我報(bào)告為廣西漢族人，且無血緣關(guān)系，并簽署知情同意書。

1.2納入、排除標(biāo)準(zhǔn)觀察組患者的納入均符合缺血性中風(fēng)的中、西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)。西醫(yī)診斷根據(jù)1995年全國第四屆腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議《各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)》［4］，所有缺血性中風(fēng)患者均經(jīng)頭顱CT和/或MRI確診；中醫(yī)診斷根據(jù)《中風(fēng)病診斷與療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》［5］對(duì)中風(fēng)患者進(jìn)行辨證分型。中風(fēng)氣虛血瘀證的主癥:半身不遂，口舌斜，言語謇澀或不語，感覺減退或消失；次癥:面色白，氣短乏力，自汗出，舌質(zhì)暗淡，舌苔白膩或有齒痕，脈沉細(xì)。觀察組中排除因腦外傷、腫瘤、心臟源性栓塞、短暫性腦缺血發(fā)作、腦血管畸形等引起的缺血性中風(fēng)；排除具有自身免疫性疾病及合并嚴(yán)重心、肝、腎功能障礙等患者。對(duì)照組病史中無冠心病、腦梗死等心腦血管疾病，身體各系統(tǒng)未發(fā)現(xiàn)重大疾病，且近期無激素、免疫抑制劑治療史。

1.3檢測方法于次日清晨采集受試者空腹外周血5 ml兩管，分裝為1管抗凝血、1管非抗凝血。抗凝血置于4℃冰箱保存，于1周內(nèi)提取血液基因組DNA。基因組DNA的提取應(yīng)用北京天根科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒［TIANamp Blood DNA Kit（離心柱形）］從人血白細(xì)胞中提取，其提取過程嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作步驟進(jìn)行，將提取出的基因組DNA置于-80℃保存?zhèn)溆谩１狙芯康囊镌O(shè)計(jì)、引物合成及基因分型檢測等實(shí)驗(yàn)過程主要由博淼生物科技（北京）有限公司嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程完成:引物設(shè)計(jì)使用Sequenom Assay Designer 3.1軟件（Sequenom，San Diego，CA，USA）進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物序列為:正義鏈:5'-ACGTTGGATGCATTGAGAAGGATGAGGAGC-3'；反義鏈:5'-ACGTTGGATGTTTGTGTGCTTGTACATTC-3'；采用Sequenom Mass ARRAY iPLEX平臺(tái)進(jìn)行基因分型檢測。此外，1管非抗凝血用于患者血清血脂水平［包括總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）、低密度脂蛋白（LDL-C）］的檢測，采用HITACHI日立7600全自動(dòng)生化分析儀測定。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法運(yùn)用PLINK統(tǒng)計(jì)軟件分析rs2107595多態(tài)性基因型與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證及其血脂水平之間的遺傳關(guān)聯(lián):Hardy-Weinberg平衡分析采用擬和優(yōu)度χ2檢驗(yàn)；各基因型與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的關(guān)聯(lián)應(yīng)用非條件Logistic回歸模型分析，其關(guān)聯(lián)強(qiáng)度以比值比（OR）及95%置信區(qū)間（CI）表示；采用一般線性回歸分析位點(diǎn)與血清血脂水平的關(guān)聯(lián)。另外，采用SPSS16.0軟件對(duì)性別、年齡等一般資料進(jìn)行組間比較:計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1基因型、等位基因型分布及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

見表1。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示:在對(duì)照組中，rs2107595多態(tài)性的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律（P=0.927）。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示:在缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的觀察組與對(duì)照組間，rs2107595多態(tài)性的基因型、等位基因型分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）。

表1　rs2107595多態(tài)性的基因型、等位基因型分布

2.2rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的關(guān)聯(lián)分析

見表2。rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（各遺傳模型均P＞0.05），在調(diào)整年齡、性別因素后，其關(guān)聯(lián)亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（各遺傳模型均P＞0.05）。

表2　rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的關(guān)聯(lián)

2.3rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證血脂水平的關(guān)聯(lián)分析見表3。rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證患者的血清TC水平顯著關(guān)聯(lián)（加性模型:β=-0.13，OR= -0.25～-0.01，P=0.035），而與氣虛血瘀證患者的血清TG、HDL-C、LDL-C水平之間的關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

表3　rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證血脂水平的關(guān)聯(lián)

3　討論

《素問·調(diào)經(jīng)論篇》第六十二篇曰“血?dú)獠缓?，百病乃變化而生”，指出氣血不和是疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。有學(xué)者［6］認(rèn)為中風(fēng)病的發(fā)生，即是在氣血內(nèi)虛的基礎(chǔ)上，遇憂思勞倦、嗜食厚味、煙酒等誘因，引起臟腑陰陽失調(diào)、氣血逆亂所致的一種疾病?！督饏T要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證并治》也提出正氣虧虛則脈絡(luò)空虛，風(fēng)邪乘虛入中，致使經(jīng)脈阻滯而引發(fā)中風(fēng)。清·王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》云“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血虛無氣，必停留而瘀”，亦認(rèn)為氣虛可導(dǎo)致血瘀，繼而相兼為病的學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。鮑遠(yuǎn)程等［7］探討了缺血性中風(fēng)的證候特點(diǎn)，明確指出氣虛、血瘀是缺血性中風(fēng)的最常見證候要素?？梢?，氣虛是中風(fēng)病發(fā)生的根源，血瘀則是其核心［8］。有鑒于此，本研究主要針對(duì)氣虛血瘀型缺血性中風(fēng)進(jìn)行分析，探討其與GWAS識(shí)別的遺傳變異rs2107595多態(tài)性的遺傳關(guān)聯(lián)，為缺血性中風(fēng)中醫(yī)證候的現(xiàn)代發(fā)病機(jī)制提供分子生物學(xué)依據(jù)。

GWAS在全基因組范圍內(nèi)分析遺傳變異與表觀特征的關(guān)系［9］，具有樣本量大、算法嚴(yán)格、重復(fù)驗(yàn)證的特點(diǎn)，可有效地識(shí)別復(fù)雜疾病的常見遺傳變異。目前，在阿爾茨海默病、糖尿病、前列腺癌、肺癌等一系列復(fù)雜疾病中進(jìn)行的GWAS較多，而關(guān)于中風(fēng)的GWAS開展尚少，但均成功發(fā)現(xiàn)了疾病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)。需注意的是，由于復(fù)雜疾病本身具有遺傳異質(zhì)性，且其發(fā)生機(jī)制在不同人群中也存在種族差異，所以某一種族人群GWAS所發(fā)現(xiàn)的陽性關(guān)聯(lián)仍需在不同種族人群中進(jìn)行驗(yàn)證。本研究即是對(duì)既往歐洲人GWAS［2-3］識(shí)別的易感位點(diǎn)在中國人群中的進(jìn)一步驗(yàn)證，結(jié)果顯示中國南方漢族人rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無顯著關(guān)聯(lián)。根據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫的最小等位基因頻率（MAF）數(shù)據(jù)，顯示rs2107595多態(tài)性分別在歐洲人群、中國人群的MAF 為0.200、0.311，可見該位點(diǎn)的等位基因頻率分布存在一定的種族差異。此外，由于受到樣本量的限制，不能提供足夠高的檢驗(yàn)效能，從而產(chǎn)生不一致的易感性關(guān)聯(lián)結(jié)果，故仍需在不同種族人群擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，血脂代謝異常是腦動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵，動(dòng)脈粥樣硬化則是中風(fēng)發(fā)生的病理基礎(chǔ)，血脂異常被認(rèn)為是中風(fēng)發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。本研究分析了rs2107595多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的血脂水平關(guān)聯(lián)，結(jié)果顯示該位點(diǎn)與中風(fēng)氣虛血瘀證患者的血清TC顯著關(guān)聯(lián)，提示rs2107595可能參與影響中風(fēng)氣虛血瘀證的脂質(zhì)代謝過程。Markus等［10］的研究表明rs2107595多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊形成相關(guān)聯(lián)，且在動(dòng)脈粥樣斑塊中表達(dá)上調(diào)。Azghandi等［11］的研究亦顯示rs2107595多態(tài)性參與影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。由此可知，rs2107595多態(tài)性影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生，而其原因則可能是該位點(diǎn)通過參與脂質(zhì)代謝紊亂的病理過程而形成。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中風(fēng)氣虛血瘀證與血脂水平具有密切的關(guān)聯(lián)?！吨敝阜健吩啤皻鉃檠獛?，氣行則血行，氣止則血止”，指出氣血在生理、病理上的關(guān)系，認(rèn)為氣為血之統(tǒng)帥，氣能行血，反之氣的功能障礙如氣虛或氣滯，則常引起血行不利，易致血瘀。而中醫(yī)之“血瘀”是血脂代謝異常的主要證候特點(diǎn)之一，且其血液流變學(xué)改變明顯。元光鋒［12］觀察了不同證型中風(fēng)患者血脂水平變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀型中風(fēng)患者的血清TC、TG水平均顯著增高。吳玲等［13］探討了缺血性中風(fēng)恢復(fù)期不同證型之間的血脂水平差異，顯示中風(fēng)氣虛血瘀證患者的血清TC水平顯著高于其他證型。黃曉［14］研究也顯示缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證患者的血脂、血液流變學(xué)變化異常。目前有關(guān)基因多態(tài)性與缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的血脂關(guān)聯(lián)研究尚未見報(bào)道，但已有研究報(bào)道遺傳變異與中風(fēng)脂質(zhì)代謝相關(guān)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)GWAS識(shí)別的rs2107595多態(tài)性可能影響缺血性中風(fēng)氣虛血瘀證的血脂代謝，但還需進(jìn)一步開展多中心、大樣本研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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（編輯陳明偉）

Association Study on rs2107595 Polymorphism Identified by GWAS and Ischemic Stroke of Qi Deficiency and Blood Stasis

SHEN Ting－ting1，GU Lian2，CHEN Qing2，LIANG Bao－yun2，YAN Yan2
（1.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530001；2.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530023）

［Objective］To explore the association between rs2107595 polymorphism and occurrence as well as blood lipid levels of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern in the people of Han nationality of Southern China.［Methods］284 cases of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern and 605 healthy controls was selected.Sequenom MassArray genotyping technique was conducted on rs2107595 polymorphism.PLINK statistical software was applied to analyze genetic association between genotype and occurrence as well as blood lipid levels of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern.［Results］There was no significant association between rs2107595 polymorphism and occurrence of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis pattern.While rs2107595 polymorphism was associated with total serum cholesterol of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis patients statistically（additive model:P=0.035）.［Conclusions］Genetic variation in rs2107595 polymorphism may affect the blood lipid metabolism of ischemic stroke of qi deficiency and blood stasis patients.

rs2107595；ischemic stroke；qi deficiency and blood stasis pattern；serum lipid levels

R743.3

A

2095-4441（2015）04-0005-04

2015-10-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào):81260594）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào):81473670）；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào):2013GXNSFAA019145）

古聯(lián)，E-mail:gulian2012@163.com