張　蕾，茹菲亞·祖拉提，何惠宇，迪麗努爾·阿吉，胡　楊

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院口腔修復科新疆烏魯木齊830054）

不同合金烤瓷冠修復后齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化

張蕾，茹菲亞·祖拉提，何惠宇，迪麗努爾·阿吉，胡楊

（新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院口腔修復科新疆烏魯木齊830054）

目的：研究使用不同合金烤瓷冠修復后齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化。方法：選擇門診患者行下頜第一磨牙全冠修復共60例，隨機分入兩組不同合金烤瓷冠組，分別在戴入前，戴入后1個月、3個月檢查齦溝出血指數(shù)，并且采用熒光定量聚合酶鏈反應測定齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化。結果：比較修復前，鈀銀合金組的齦溝出血指數(shù)在修復后1個月、3個月無明顯升高（P＞0.05）；而鈷鉻合金組的齦溝出血指數(shù)在修復后1個月、3個月有較明顯升高（P＜0.05）；與修復前比較，鈀銀合金組的牙齦卟啉單胞菌相對定量值在修復后1、3個月無明顯增加（P＞0.05）；鈷鉻合金組在修復后1個月、3個月的牙齦卟啉單胞菌相對定量值有明顯增加（P＜0.05）。結論：兩種合金材料的烤瓷冠修復后對患者牙齦有一定的影響；其中鈷鉻合金影響明顯大于鈀銀合金。

烤瓷冠；牙齦卟啉單胞菌；熒光定量聚合酶鏈反應

自20世紀70年代烤瓷熔附金屬全冠引進中國以來，其已成為臨床上最常用的修復體之一。研究表明，修復體材料的不同對基牙牙周組織的影響不同［1］。因此探究何種合金的烤瓷冠對患者牙周組織影響較小顯得尤為重要。牙齦卟啉單胞菌是證據(jù)充分的牙周致病菌之一，并與慢性牙周炎的關系最為密切［2］。本實驗選擇行不同合金烤瓷冠修復患者，使用實時熒光定量PCR技術檢測齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌數(shù)量的變化，以期為臨床工作做一指導。

1　材料和方法

1.1病例選擇

選擇2013年12月-2014年2月就診于新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院口腔修復科，需行下頜第一磨牙全冠修復的患者共60例，年齡20～50歲，隨機分為鈀銀組和鈷鉻組，每組30人。采用自身前后對照的方法，將患者備牙前的受試牙設為對照組，冠修復后的受試牙設為試驗組。

納入標準：患者牙列完整，咬合正常，無扭轉，無頰舌側傾斜、伸長；基牙牙周健康，牙齦色澤正常，探診無出血?？梢耘浜蠌驮\。

排除標準：患有可能影響牙周組織的全身疾?。粚嶒炃?個月或實驗過程中，患呼吸系統(tǒng)疾病者或口腔軟硬組織疾病者；妊娠期婦女；對金屬材料過敏患者；無合作意愿的患者；其他一切修復治療的禁忌癥。

牙體預備標準參見《口腔修復學》第6版［3］，所有基牙肩臺制備：齦下0.5mm，寬度1mm，并且光滑連續(xù)。修復體粘結選用統(tǒng)一粘結劑。

1.2材料

1.2.1烤瓷冠材料：鈀銀合金：由義獲嘉韋瓦登特公司生產(chǎn)，主要成分鈀59.2%，銀27.9%；鈷鉻合金：由德國拜高公司生產(chǎn)，主要成分鈷61.2%，鈷26.3%。1.2.2細菌菌種：牙齦卟啉單胞菌ATCC33277由武漢大學口腔醫(yī)學院實驗室提供。

1.2.3試劑：細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），細菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）；2*TaqPCR MasterMix（天根生化科技有限公司，北京）；瓊脂糖（Biowest，Hongkong）；Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo，American）；核酸染料（北京博邁德生物工程公司）；無水乙醇（南京奧佳化工有限公司）；MarkDL 1200、MarkDL 2000（天根生化科技有限公司，北京）；BHI培養(yǎng)基、TBE電泳緩沖液均由自行配置而成。

1.2.4引物：根據(jù)相關文獻設計引物［4］及細菌通用引物［5］，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。1.3方法

1.3.1牙周臨床指標檢測：分別在基牙修復前、修復后1個月和修復后3個月檢查牙周臨床指標，由同一名醫(yī)生完成臨床操作并且記錄齦溝出血指數(shù)（SBI）。SBI根據(jù)《牙周病學》第2版描述的方法進行檢測［6］。

表1　PCR引物和探針序列

1.3.2臨床樣本采集：牙體預備前囑患者清水漱口1分鐘。采集部位以棉卷隔濕，使用無菌齦下刮治器取基牙舌側的齦下菌斑，立即置入含1mlPBS的EP管內(nèi)，冰浴下轉送實驗室并于-20℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3標準菌株：牙齦卟啉單胞菌ATCC3327737℃厭氧復蘇48h，各自挑選1個單菌落行次代培養(yǎng)（牛心腦液培養(yǎng)基），厭氧條件下（37℃，24h）用生理鹽水分別洗菌，用于DNA提取。

1.3.4DNA的制備：牙齦卟啉單胞菌的DNA提取方法均參照細菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進行。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5標準品的制備：將提取備用的牙齦卟啉單胞菌DNA用無菌水連續(xù)5倍稀釋，共稀釋7個梯度，即：101，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，備用。

1.3.6實時熒光定量PCR的定量檢測：使用配制好的標準品，進行牙齦卟啉單胞菌及內(nèi)參基因標準曲線的制備。將稀釋后的臨床樣本DNA進行熒光定量PCR檢測，并得到相應的CT值結果。熒光定量PCR的總反應體系為20μl：細菌標準品或樣本的DNA 2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，SYBR mixture 10μl，滅菌ddH2O 7μl。設置循環(huán)參數(shù)如下：預處理95℃10min；變性95℃15s；退火60℃30s；延伸72℃30s，共進行39個循環(huán)周期。所有反應均在Bio-Rad熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）上進行，每個樣本檢測均設副管，并取其平均值，每次反應均設空白對照。將得到的PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳實驗，以驗證結果的準確性。

1.4統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。修復前與修復后1個月、修復前與修復后3個月的熒光定量值的比較采用配對t檢驗。

2　結果

2.1統(tǒng)計結果

鈀銀、鈷鉻合金烤瓷冠兩組修復前與修復后1個月、3個月的SBI（見表2），鈀銀合金組沒見明顯差異（P＞0.05）；而鈷鉻合金組的齦溝出血指數(shù)在修復后1個月、3個月有較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；鈀銀、鈷鉻合金烤瓷冠兩組修復前與修復后1個月、3個月的P.gingivalis相對定量結果（見表3），與修復前比較，鈀銀合金組1個月、3個月的牙齦卟啉單胞菌相對定量值無明顯增加（P＞0.05）；鈷鉻合金組1個月、3個月的牙齦卟啉單胞菌相對定量有明顯值增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表2　兩組修復前后SBI（±s）

表2　兩組修復前后SBI（±s）

注：與修復前比較，鈀銀合金組的齦溝出血指數(shù)在修復后1個月、3個月無明顯升高（P＞0.05）；而鈷鉻合金組的齦溝出血指數(shù)在修復后1個月、3個月有較明顯升高（P＜0.05）

組別鈀銀合金組鈷鉻合金組例數(shù)30 30 0個月0.24±0.49 0.27±0.46 1個月0.71±0.15 1.37±0.51 3個月0.56±0.21 1.27±0.38

表3　鈀銀合金組與鈷鉻合金組冠修復后P.gingivalis相對定量結果（±s）

表3　鈀銀合金組與鈷鉻合金組冠修復后P.gingivalis相對定量結果（±s）

注：與修復前比較，鈀銀合金組1個月、3個月的牙齦卟啉單胞菌相對定量值無明顯增加（P＞0.05）；鈷鉻合金組1個月、3個月的牙齦卟啉單胞菌相對定量值有明顯增加（P＜0.05）

組別鈀銀合金組鈷鉻合金組例數(shù)30 30 2-△△CT 0個月1±0 1±0 1個月1.12±0.15 1.93±0.71 3個月1.09±0.13 1.55±0.46

2.2牙齦卟啉單胞菌及內(nèi)參基因的標準曲線標曲圖

本實驗通過對引物及反應條件的不斷優(yōu)化，使得牙齦卟啉單胞菌及內(nèi)參基因的擴增效率基本達到一致，可以用相對標準曲線法對樣本中牙齦卟啉單胞菌的表達進行相對定量分析（如圖1、圖2）。

2.3臨床樣本real-time PCR結果檢驗

將樣本進行實時熒光定量檢測之后行電泳試驗，電泳圖顯示產(chǎn)物均為單一亮帶，未見引物二聚體。

圖1　牙齦卟啉單胞菌標準曲線圖

圖2　樣本牙齦卟啉單胞菌q-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3　樣本內(nèi)參基因q-PCR產(chǎn)物電泳圖

3　討論

烤瓷熔附金屬全冠作為目前臨床中最常見，也是固定義齒修復的主要的修復方式。隨著口腔材料學的不斷發(fā)展和口腔加工工藝的不斷改進，很多貴金屬材料已應用于烤瓷冠的加工，逐步取代原先使用的非貴金屬材料。

烤瓷熔附金屬全冠對于牙周組織的影響是多因素造成的，如：全冠采用的材料、冠邊緣的位置、形態(tài)、所用的粘結劑等等［7］?？谇画h(huán)境潮濕，復雜，在各個部位存在大量的細菌，但不是存在細菌就會引起牙周的病變，細菌和宿主間存在動態(tài)的平衡。正如烤瓷冠的介入打破了這種平衡就會引起微生態(tài)的失調(diào)，細菌粘附增多，牙周組織遭到破壞。臨床中可以通過齦溝液的變化、齦溝出血指數(shù)等客觀反應牙齦的變化。而口腔微環(huán)境變化的進一步研究有待于實驗室研究。牙齦卟啉單胞菌是公認的牙周可疑致病菌之一，與牙周炎的始動因子、趨化密切相關。

本研究選擇齦溝出血指數(shù)作為臨床牙周指標，從宏觀上觀察患者在戴入不同合金烤瓷冠前后牙周組織的變化；并且為進一步研究，微觀上選擇目前準確度較高的實時定量PCR法進行檢測牙齦卟啉單胞菌相對定量的變化。旨在多角度評估不同金屬內(nèi)冠的烤瓷冠在牙周組織方面的影響，以期為臨床提供更好的指導。

烤瓷熔附金屬全冠最早期在臨床中的應用多為鎳鉻合金，隨著口腔材料的不斷發(fā)展，現(xiàn)在已被鈷鉻合金、鈀銀合金、純鈦等替代。

鈷鉻合金具有良好的機械性能、低廉的成本，作為非貴金屬應用于齒科修復材料。它較鎳鉻合金有較好的生物相容性，穩(wěn)定性。李宏洋［1］等通過研究認為鈷鉻合金對牙周組織的不利影響是客觀存在的。鈀銀合金是僅次于金合金，廣泛應用的貴金屬齒科修復材料。它生物相容性好，抗腐蝕性強，對牙周組織刺激小，是烤瓷合金中理想的材料。故本研究選取這兩種臨床最常用的合金烤瓷冠的基牙為研究對象。

金屬材料對牙周的影響主要是材料在口腔環(huán)境中發(fā)生腐蝕，牙周問題成為臨床導致修復失敗的原因［8］。有研究發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金能刺激人單核細胞合成和釋放腫瘤壞死因子，誘發(fā)單核細胞凋亡，引起周圍組織炎癥［9］。

本研究中修復體邊緣設計在牙齦下0.5mm，肩臺充分拋光；選取同一種粘結劑。是為了避免全冠邊緣對牙齦的刺激，盡量減少干擾因素。實驗結果顯示牙齦出血指數(shù)在戴入修復體后1個月、3個月，鈀銀合金組較戴入前無明顯差異，而鈷鉻合金組卻有明顯升高，故鈀銀合金組優(yōu)于鈷鉻合金組；實時定量PCR試驗中牙齦卟啉單胞菌相對定量結果也同前。說明烤瓷冠修復后對患者牙齦是有一定的影響，但是這種影響不一定是致病性的影響。鈀銀合金性能優(yōu)于鈷鉻合金。這與諸位學者［1，10］研究結果一致。實驗結果顯示戴入修復體后3個月同1個月相比無明顯差異，且有下降趨勢。筆者分析，患者戴入修復體1個月時，口腔微環(huán)境動態(tài)平衡被打亂，需要一定時間恢復，故在3個月時趨于穩(wěn)定。此推測需進一步證實?？稍龃髽颖玖浚娱L觀察時間，可能會得出具有統(tǒng)計學意義的結果。

［1］李洪洋，鐘麗芳，劉兵，等.鈷鉻合金及鈀銀合金烤瓷冠對牙周組織的影響［J］.中國組織工程研究，2013，17（21）：3893-3900.

［2］Socransky SS，Haffajee AD.The bacterial of destructive periodontal disease：Current concepts［J］.J Periodontol，1992，63（4 Suppl）：322-331.

［3］趙銥民.口腔修復學［M］.6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：73-74.

［4］陸卉，周慧敏，宋曉波.成人正畸患者齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化［J］.華西口腔醫(yī)學雜志，2010，28（2）：166-169.

［5］劉芳，馮錦虹，仵楠，等.維吾爾族和漢族不同齲敏感兒童遠緣鏈球菌的熒光定量PCR檢測［J］.新疆醫(yī)科大學學報，2013，36（4）：494-499.

［6］曹采方.牙周病學［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：87-90.

［7］孟煥新.牙周病學［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：118-120.

［8］Al-Salehi SK，Hatton PV，Johnson A.et al.The effect of hydrogen peroxide concentration on metal ion release from dental casting alloys［J］.J Oral Rehabil，2008：35（4）：276-282.

［9］Lopez-Alias JF，Martinez-Gomis J，Anglada JM，et al.Ion releasefromdentalcastingalloysasassessedbya continuousflowsystem：Nutritionalandtoxicological implications［J］.Dent Mater，2006：22（9）：832-837.

［10］譚榮.固定修復對于牙周組織健康狀況的影響［J］.口腔醫(yī)學研究，2014，10（10）：970-973.

編輯/張惠娟

Quantitative study on P.gingivalis on different alloy porclain crown

ZHANG Lei，Rufiya·Zulati，HE Hui-yu，Dilinuer·Aji，HU Yang
（Department of Prosthodontics，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To investigate the variation of P.gingivalis influenced by different alloy porclain crown.Methods A total of 60 patients，need restoration treatment of mandibular first molar by PFM crown，they were all randomly chosen to participate in two groups-sliver-palladium alloy porclain group or cobalt-chromium alloy porclain group that each one is 30 petients.We used Polymerace Chain Reaction to have quantitative determination for P.gingivalis，and check up the SBI before and after restoration one and three months.Results Compared with those before restoration.The SBI of one and three months after restoration in the cobalt-chromium alloy porclain group is higher（P＜0.05）while in the sliver-palladium alloy porclain group is not changed（P＞0.05）.Also the same results turn out in the quantities of P.gingivalis after Poly-merace Chain Reaction.Conclusion PFM crowns may have some effects on variation of P.gingivalis.The sliver-palladium alloy porclain is better than the cobaltchromium alloy porclain.So the sliver-palladium alloy is an ideal substrate material of PFM crown.

PFM crown；Porphyromonas gingivalis；Poly-merace Chain Reaction

R783.3

A

1008-6455（2015）15-0038-04

新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院院級青年科研專項基金（項目編號：2012QN03；新疆維吾爾自治區(qū)科技廳自然科學基金（項目編號：2014211C037）

胡楊，漢族，主治醫(yī)師；研究方向：組織工程骨構建；E-mail∶joe98344@126.com

2015-06-08

2015-07-30