張　蕾，茹菲亞·祖拉提，何惠宇，迪麗努爾·阿吉，胡　楊

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科新疆烏魯木齊830054）

不同合金烤瓷冠修復(fù)后齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化

張蕾，茹菲亞·祖拉提，何惠宇，迪麗努爾·阿吉，胡楊

（新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科新疆烏魯木齊830054）

目的：研究使用不同合金烤瓷冠修復(fù)后齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化。方法：選擇門診患者行下頜第一磨牙全冠修復(fù)共60例，隨機(jī)分入兩組不同合金烤瓷冠組，分別在戴入前，戴入后1個(gè)月、3個(gè)月檢查齦溝出血指數(shù)，并且采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化。結(jié)果：比較修復(fù)前，鈀銀合金組的齦溝出血指數(shù)在修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月無明顯升高（P＞0.05）；而鈷鉻合金組的齦溝出血指數(shù)在修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月有較明顯升高（P＜0.05）；與修復(fù)前比較，鈀銀合金組的牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量值在修復(fù)后1、3個(gè)月無明顯增加（P＞0.05）；鈷鉻合金組在修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月的牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量值有明顯增加（P＜0.05）。結(jié)論：兩種合金材料的烤瓷冠修復(fù)后對(duì)患者牙齦有一定的影響；其中鈷鉻合金影響明顯大于鈀銀合金。

烤瓷冠；牙齦卟啉單胞菌；熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

自20世紀(jì)70年代烤瓷熔附金屬全冠引進(jìn)中國以來，其已成為臨床上最常用的修復(fù)體之一。研究表明，修復(fù)體材料的不同對(duì)基牙牙周組織的影響不同［1］。因此探究何種合金的烤瓷冠對(duì)患者牙周組織影響較小顯得尤為重要。牙齦卟啉單胞菌是證據(jù)充分的牙周致病菌之一，并與慢性牙周炎的關(guān)系最為密切［2］。本實(shí)驗(yàn)選擇行不同合金烤瓷冠修復(fù)患者，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌數(shù)量的變化，以期為臨床工作做一指導(dǎo)。

1　材料和方法

1.1病例選擇

選擇2013年12月-2014年2月就診于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科，需行下頜第一磨牙全冠修復(fù)的患者共60例，年齡20～50歲，隨機(jī)分為鈀銀組和鈷鉻組，每組30人。采用自身前后對(duì)照的方法，將患者備牙前的受試牙設(shè)為對(duì)照組，冠修復(fù)后的受試牙設(shè)為試驗(yàn)組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患者牙列完整，咬合正常，無扭轉(zhuǎn)，無頰舌側(cè)傾斜、伸長；基牙牙周健康，牙齦色澤正常，探診無出血?？梢耘浜蠌?fù)診。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患有可能影響牙周組織的全身疾病；實(shí)驗(yàn)前3個(gè)月或?qū)嶒?yàn)過程中，患呼吸系統(tǒng)疾病者或口腔軟硬組織疾病者；妊娠期婦女；對(duì)金屬材料過敏患者；無合作意愿的患者；其他一切修復(fù)治療的禁忌癥。

牙體預(yù)備標(biāo)準(zhǔn)參見《口腔修復(fù)學(xué)》第6版［3］，所有基牙肩臺(tái)制備：齦下0.5mm，寬度1mm，并且光滑連續(xù)。修復(fù)體粘結(jié)選用統(tǒng)一粘結(jié)劑。

1.2材料

1.2.1烤瓷冠材料：鈀銀合金：由義獲嘉韋瓦登特公司生產(chǎn)，主要成分鈀59.2%，銀27.9%；鈷鉻合金：由德國拜高公司生產(chǎn)，主要成分鈷61.2%，鈷26.3%。1.2.2細(xì)菌菌種：牙齦卟啉單胞菌ATCC33277由武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2.3試劑：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司，北京）；2*TaqPCR MasterMix（天根生化科技有限公司，北京）；瓊脂糖（Biowest，Hongkong）；Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（Thermo，American）；核酸染料（北京博邁德生物工程公司）；無水乙醇（南京奧佳化工有限公司）；MarkDL 1200、MarkDL 2000（天根生化科技有限公司，北京）；BHI培養(yǎng)基、TBE電泳緩沖液均由自行配置而成。

1.2.4引物：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物［4］及細(xì)菌通用引物［5］，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。1.3方法

1.3.1牙周臨床指標(biāo)檢測(cè)：分別在基牙修復(fù)前、修復(fù)后1個(gè)月和修復(fù)后3個(gè)月檢查牙周臨床指標(biāo)，由同一名醫(yī)生完成臨床操作并且記錄齦溝出血指數(shù)（SBI）。SBI根據(jù)《牙周病學(xué)》第2版描述的方法進(jìn)行檢測(cè)［6］。

表1　PCR引物和探針序列

1.3.2臨床樣本采集：牙體預(yù)備前囑患者清水漱口1分鐘。采集部位以棉卷隔濕，使用無菌齦下刮治器取基牙舌側(cè)的齦下菌斑，立即置入含1mlPBS的EP管內(nèi)，冰浴下轉(zhuǎn)送實(shí)驗(yàn)室并于-20℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)菌株：牙齦卟啉單胞菌ATCC3327737℃厭氧復(fù)蘇48h，各自挑選1個(gè)單菌落行次代培養(yǎng)（牛心腦液培養(yǎng)基），厭氧條件下（37℃，24h）用生理鹽水分別洗菌，用于DNA提取。

1.3.4DNA的制備：牙齦卟啉單胞菌的DNA提取方法均參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作步驟進(jìn)行。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將提取備用的牙齦卟啉單胞菌DNA用無菌水連續(xù)5倍稀釋，共稀釋7個(gè)梯度，即：101，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，備用。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量檢測(cè)：使用配制好的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行牙齦卟啉單胞菌及內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。將稀釋后的臨床樣本DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，并得到相應(yīng)的CT值結(jié)果。熒光定量PCR的總反應(yīng)體系為20μl：細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的DNA 2μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，SYBR mixture 10μl，滅菌ddH2O 7μl。設(shè)置循環(huán)參數(shù)如下：預(yù)處理95℃10min；變性95℃15s；退火60℃30s；延伸72℃30s，共進(jìn)行39個(gè)循環(huán)周期。所有反應(yīng)均在Bio-Rad熒光定量PCR儀（Bio-Rad，美國）上進(jìn)行，每個(gè)樣本檢測(cè)均設(shè)副管，并取其平均值，每次反應(yīng)均設(shè)空白對(duì)照。將得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。修復(fù)前與修復(fù)后1個(gè)月、修復(fù)前與修復(fù)后3個(gè)月的熒光定量值的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。

2　結(jié)果

2.1統(tǒng)計(jì)結(jié)果

鈀銀、鈷鉻合金烤瓷冠兩組修復(fù)前與修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月的SBI（見表2），鈀銀合金組沒見明顯差異（P＞0.05）；而鈷鉻合金組的齦溝出血指數(shù)在修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月有較明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；鈀銀、鈷鉻合金烤瓷冠兩組修復(fù)前與修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月的P.gingivalis相對(duì)定量結(jié)果（見表3），與修復(fù)前比較，鈀銀合金組1個(gè)月、3個(gè)月的牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量值無明顯增加（P＞0.05）；鈷鉻合金組1個(gè)月、3個(gè)月的牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量有明顯值增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2　兩組修復(fù)前后SBI（±s）

表2　兩組修復(fù)前后SBI（±s）

注：與修復(fù)前比較，鈀銀合金組的齦溝出血指數(shù)在修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月無明顯升高（P＞0.05）；而鈷鉻合金組的齦溝出血指數(shù)在修復(fù)后1個(gè)月、3個(gè)月有較明顯升高（P＜0.05）

組別鈀銀合金組鈷鉻合金組例數(shù)30 30 0個(gè)月0.24±0.49 0.27±0.46 1個(gè)月0.71±0.15 1.37±0.51 3個(gè)月0.56±0.21 1.27±0.38

表3　鈀銀合金組與鈷鉻合金組冠修復(fù)后P.gingivalis相對(duì)定量結(jié)果（±s）

表3　鈀銀合金組與鈷鉻合金組冠修復(fù)后P.gingivalis相對(duì)定量結(jié)果（±s）

注：與修復(fù)前比較，鈀銀合金組1個(gè)月、3個(gè)月的牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量值無明顯增加（P＞0.05）；鈷鉻合金組1個(gè)月、3個(gè)月的牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量值有明顯增加（P＜0.05）

組別鈀銀合金組鈷鉻合金組例數(shù)30 30 2-△△CT 0個(gè)月1±0 1±0 1個(gè)月1.12±0.15 1.93±0.71 3個(gè)月1.09±0.13 1.55±0.46

2.2牙齦卟啉單胞菌及內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)曲圖

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)引物及反應(yīng)條件的不斷優(yōu)化，使得牙齦卟啉單胞菌及內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率基本達(dá)到一致，可以用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)樣本中牙齦卟啉單胞菌的表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量分析（如圖1、圖2）。

2.3臨床樣本real-time PCR結(jié)果檢驗(yàn)

將樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)之后行電泳試驗(yàn)，電泳圖顯示產(chǎn)物均為單一亮帶，未見引物二聚體。

圖1　牙齦卟啉單胞菌標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖2　樣本牙齦卟啉單胞菌q-PCR產(chǎn)物電泳圖

圖3　樣本內(nèi)參基因q-PCR產(chǎn)物電泳圖

3　討論

烤瓷熔附金屬全冠作為目前臨床中最常見，也是固定義齒修復(fù)的主要的修復(fù)方式。隨著口腔材料學(xué)的不斷發(fā)展和口腔加工工藝的不斷改進(jìn)，很多貴金屬材料已應(yīng)用于烤瓷冠的加工，逐步取代原先使用的非貴金屬材料。

烤瓷熔附金屬全冠對(duì)于牙周組織的影響是多因素造成的，如：全冠采用的材料、冠邊緣的位置、形態(tài)、所用的粘結(jié)劑等等［7］。口腔環(huán)境潮濕，復(fù)雜，在各個(gè)部位存在大量的細(xì)菌，但不是存在細(xì)菌就會(huì)引起牙周的病變，細(xì)菌和宿主間存在動(dòng)態(tài)的平衡。正如烤瓷冠的介入打破了這種平衡就會(huì)引起微生態(tài)的失調(diào)，細(xì)菌粘附增多，牙周組織遭到破壞。臨床中可以通過齦溝液的變化、齦溝出血指數(shù)等客觀反應(yīng)牙齦的變化。而口腔微環(huán)境變化的進(jìn)一步研究有待于實(shí)驗(yàn)室研究。牙齦卟啉單胞菌是公認(rèn)的牙周可疑致病菌之一，與牙周炎的始動(dòng)因子、趨化密切相關(guān)。

本研究選擇齦溝出血指數(shù)作為臨床牙周指標(biāo)，從宏觀上觀察患者在戴入不同合金烤瓷冠前后牙周組織的變化；并且為進(jìn)一步研究，微觀上選擇目前準(zhǔn)確度較高的實(shí)時(shí)定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量的變化。旨在多角度評(píng)估不同金屬內(nèi)冠的烤瓷冠在牙周組織方面的影響，以期為臨床提供更好的指導(dǎo)。

烤瓷熔附金屬全冠最早期在臨床中的應(yīng)用多為鎳鉻合金，隨著口腔材料的不斷發(fā)展，現(xiàn)在已被鈷鉻合金、鈀銀合金、純鈦等替代。

鈷鉻合金具有良好的機(jī)械性能、低廉的成本，作為非貴金屬應(yīng)用于齒科修復(fù)材料。它較鎳鉻合金有較好的生物相容性，穩(wěn)定性。李宏洋［1］等通過研究認(rèn)為鈷鉻合金對(duì)牙周組織的不利影響是客觀存在的。鈀銀合金是僅次于金合金，廣泛應(yīng)用的貴金屬齒科修復(fù)材料。它生物相容性好，抗腐蝕性強(qiáng)，對(duì)牙周組織刺激小，是烤瓷合金中理想的材料。故本研究選取這兩種臨床最常用的合金烤瓷冠的基牙為研究對(duì)象。

金屬材料對(duì)牙周的影響主要是材料在口腔環(huán)境中發(fā)生腐蝕，牙周問題成為臨床導(dǎo)致修復(fù)失敗的原因［8］。有研究發(fā)現(xiàn)鈷鉻合金能刺激人單核細(xì)胞合成和釋放腫瘤壞死因子，誘發(fā)單核細(xì)胞凋亡，引起周圍組織炎癥［9］。

本研究中修復(fù)體邊緣設(shè)計(jì)在牙齦下0.5mm，肩臺(tái)充分拋光；選取同一種粘結(jié)劑。是為了避免全冠邊緣對(duì)牙齦的刺激，盡量減少干擾因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示牙齦出血指數(shù)在戴入修復(fù)體后1個(gè)月、3個(gè)月，鈀銀合金組較戴入前無明顯差異，而鈷鉻合金組卻有明顯升高，故鈀銀合金組優(yōu)于鈷鉻合金組；實(shí)時(shí)定量PCR試驗(yàn)中牙齦卟啉單胞菌相對(duì)定量結(jié)果也同前。說明烤瓷冠修復(fù)后對(duì)患者牙齦是有一定的影響，但是這種影響不一定是致病性的影響。鈀銀合金性能優(yōu)于鈷鉻合金。這與諸位學(xué)者［1，10］研究結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示戴入修復(fù)體后3個(gè)月同1個(gè)月相比無明顯差異，且有下降趨勢(shì)。筆者分析，患者戴入修復(fù)體1個(gè)月時(shí)，口腔微環(huán)境動(dòng)態(tài)平衡被打亂，需要一定時(shí)間恢復(fù)，故在3個(gè)月時(shí)趨于穩(wěn)定。此推測(cè)需進(jìn)一步證實(shí)?？稍龃髽颖玖浚娱L觀察時(shí)間，可能會(huì)得出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果。

［1］李洪洋，鐘麗芳，劉兵，等.鈷鉻合金及鈀銀合金烤瓷冠對(duì)牙周組織的影響［J］.中國組織工程研究，2013，17（21）：3893-3900.

［2］Socransky SS，Haffajee AD.The bacterial of destructive periodontal disease：Current concepts［J］.J Periodontol，1992，63（4 Suppl）：322-331.

［3］趙銥民.口腔修復(fù)學(xué)［M］.6版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：73-74.

［4］陸卉，周慧敏，宋曉波.成人正畸患者齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌的變化［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2010，28（2）：166-169.

［5］劉芳，馮錦虹，仵楠，等.維吾爾族和漢族不同齲敏感兒童遠(yuǎn)緣鏈球菌的熒光定量PCR檢測(cè)［J］.新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（4）：494-499.

［6］曹采方.牙周病學(xué)［M］.2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：87-90.

［7］孟煥新.牙周病學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：118-120.

［8］Al-Salehi SK，Hatton PV，Johnson A.et al.The effect of hydrogen peroxide concentration on metal ion release from dental casting alloys［J］.J Oral Rehabil，2008：35（4）：276-282.

［9］Lopez-Alias JF，Martinez-Gomis J，Anglada JM，et al.Ion releasefromdentalcastingalloysasassessedbya continuousflowsystem：Nutritionalandtoxicological implications［J］.Dent Mater，2006：22（9）：832-837.

［10］譚榮.固定修復(fù)對(duì)于牙周組織健康狀況的影響［J］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2014，10（10）：970-973.

編輯/張惠娟

Quantitative study on P.gingivalis on different alloy porclain crown

ZHANG Lei，Rufiya·Zulati，HE Hui-yu，Dilinuer·Aji，HU Yang
（Department of Prosthodontics，The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University，Urumqi 830054，Xinjiang，China）

Objective To investigate the variation of P.gingivalis influenced by different alloy porclain crown.Methods A total of 60 patients，need restoration treatment of mandibular first molar by PFM crown，they were all randomly chosen to participate in two groups-sliver-palladium alloy porclain group or cobalt-chromium alloy porclain group that each one is 30 petients.We used Polymerace Chain Reaction to have quantitative determination for P.gingivalis，and check up the SBI before and after restoration one and three months.Results Compared with those before restoration.The SBI of one and three months after restoration in the cobalt-chromium alloy porclain group is higher（P＜0.05）while in the sliver-palladium alloy porclain group is not changed（P＞0.05）.Also the same results turn out in the quantities of P.gingivalis after Poly-merace Chain Reaction.Conclusion PFM crowns may have some effects on variation of P.gingivalis.The sliver-palladium alloy porclain is better than the cobaltchromium alloy porclain.So the sliver-palladium alloy is an ideal substrate material of PFM crown.

PFM crown；Porphyromonas gingivalis；Poly-merace Chain Reaction

R783.3

A

1008-6455（2015）15-0038-04

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院院級(jí)青年科研專項(xiàng)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2012QN03；新疆維吾爾自治區(qū)科技廳自然科學(xué)基金（項(xiàng)目編號(hào)：2014211C037）

胡楊，漢族，主治醫(yī)師；研究方向：組織工程骨構(gòu)建；E-mail∶joe98344@126.com

2015-06-08

2015-07-30