毋　磊，董　斌，李廣帥，劉林嶓

（1.鄭州市第一人民醫(yī)院整形外科河南鄭州450004；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科河南鄭州450052）

·基礎(chǔ)研究·

HDAC6、p21WAF1/CIP1和CyclinD1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達

毋磊1，董斌1，李廣帥2，劉林嶓2

（1.鄭州市第一人民醫(yī)院整形外科河南鄭州450004；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科河南鄭州450052）

目的：檢測皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）組織中HDAC6、p21WAF1/CIP1及CyclinD1的表達。方法：采用免疫組織化學(xué)SP法檢測40例SCC及15例正常皮膚組織中HDAC6、p21WAF1/CIP1及CyclinD1的表達。結(jié)果：SCC組織中HDAC6及CyclinD1陽性表達率（70.0%、72.5%）均高于正常皮膚組織（33.3%、40.0%），p21WAF1/CIP1陽性表達率（32.5%）低于正常皮膚組織（66.7%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。SCC組織中HDAC6與p21WAF1/CIP1表達呈負(fù)相關(guān)（r=-0.594，P=0.000），HDAC6與CyclinD1表達呈正相關(guān)（r=0.330，P=0.038）。結(jié)論：HDAC6在SCC中可能通過影響p21WAF1/CIP1及CyclinD1對腫瘤細(xì)胞的增殖分化產(chǎn)生影響，為HDAC6抑制劑應(yīng)用于SCC的治療提供理論依據(jù)。

組蛋白去乙?；?；p21WAF1/CIP1；細(xì)胞周期蛋白D1；皮膚鱗狀細(xì)胞癌

組蛋白的乙酰化和去乙?；腔虮磉_過程中重要的調(diào)控方式，是轉(zhuǎn)錄過程中的關(guān)鍵修飾。研究表明組蛋白乙酰化和去乙?；c腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系。組蛋白乙?；癄顟B(tài)取決于組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶（HATs）與組蛋白去乙?；福℉DACs）之間的活性競爭。HATs與HDACs之間平衡的紊亂常使基因表達失控［1］。組蛋白去乙酰化酶6（Histone deacetylase 6，HDAC6）通過去除組蛋白的乙?；推渌D(zhuǎn)錄調(diào)控參與腫瘤發(fā)生和進展。細(xì)胞周期的正常運行，依賴于周期蛋白、周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）和周期蛋白依賴性激酶抑制因子（CDK inhibitor，CDKI）系統(tǒng)，細(xì)胞周期失去正常的信息調(diào)控而處于紊亂無序的狀態(tài)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。為了解HDAC6、p21WAF1/CIP1及CyclinD1在SCC中的作用，作者檢測了40例SCC組織及正常皮膚組織中HDAC6、p21WAF1/CIP1及CyclinD1的表達，并分析HDAC6與p21WAF1/CIP1及CyclinD1的相關(guān)性。

1　材料和方法

1.1標(biāo)本收集

收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2010年9月-2011年3月歸檔的皮膚鱗狀細(xì)胞癌蠟塊標(biāo)本40例，男25例，女15例，年齡36～85歲，均有完整的病史資料和明確的組織病理學(xué)診斷。所有的病例術(shù)前均未接受放療、化療以及生物免疫治療。15例正常皮膚來源于植皮手術(shù)修剪剩余的全厚皮片。

1.2主要試劑

HDAC6兔抗人多克隆抗體、p21WAF1/CIP1兔抗人多克隆抗體、CyclinD1兔抗人多克隆抗體和免疫組織化學(xué)染色試劑盒均購自北京博奧森生物科技有限公司，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋科技有限公司。

1.3步驟方法

采用免疫組化SP法進行檢測，按染色試劑盒步驟操作。HDAC6工作液濃度為1∶200，p21WAF1/CIP1工作液濃度為1∶100，CyclinD1工作濃度為1∶200。

1.4結(jié)果判定

細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，在高倍鏡下每張切片隨機選取10個視野，每個視野選取200個細(xì)胞。（1）按陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比評分：陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞數(shù)的25%以下為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。（2）按著色程度評分：無顯色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。取2項積分的乘積為總積分，0～1分為（-），≥2分為（+）。每張切片經(jīng)兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師在光鏡下獨立完成，當(dāng)結(jié)果不一致時，重新計數(shù)。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包行χ2檢驗及2×2配對資料的關(guān)聯(lián)性分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

圖1　A正常皮膚HDAC6蛋白表達（IHC×200）

圖1　B皮膚鱗狀細(xì)胞癌HDAC6蛋白表達（IHC×200）

圖2　A正常皮膚p21WAF1/CIP1蛋白表達（IHC×200）

圖2　B皮膚鱗狀細(xì)胞癌p21WAF1/CIP1蛋白表達（IHC×200）

圖3　A正常皮膚CyclinD1蛋白表達（IHC×200）

圖3　B皮膚鱗狀細(xì)胞癌CyclinD1蛋白表達（IHC×200）

2　結(jié)果

2.1HDAC6、p21WAF1/CIP1及CyclinD1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌及正常皮膚組織中的表達情況。見圖1、2、3及表1。

表2　SCC組織中HDAC6與p21WAF1/CIP1及CyclinD1表達的相關(guān)性

表1　不同組織中HDAC6、p21WAF1/CIP1及CyclinD1的表達情況比較［例（%）］

2.2SCC組織中HDAC6與p21WAF1/CIP1及CyclinD1的相關(guān)性。見表2，通過對HDAC6與p21WAF1/CIP1、CyclinD1的關(guān)聯(lián)性分析，證實HDAC6的過表達與p21WAF1/CIP1的表達降低呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與CyclinD1的過表達呈正相關(guān)關(guān)系。

3　討論

SCC是常見的皮膚惡性腫瘤，發(fā)病率約占全部非黑素細(xì)胞癌的20%。研究表明，遺傳學(xué)和表遺傳學(xué)（epigenenetics）改變引起癌基因活化和抑癌基因失活是腫瘤發(fā)生的核心生物學(xué)進程。

HDAC6歸于HDACs家族的第Ⅱ類，HDAC6基因定位于X染色體11p23區(qū)帶，在人體內(nèi)證實由1216個氨基酸組成［2］。絕大數(shù)的HDACs位于細(xì)胞核中，但是第Ⅱ類的HDACs能夠轉(zhuǎn)移去細(xì)胞質(zhì)中［3］。HDAC6有別于其它HDACs家族成員的重要特點是唯一具有兩個催化位點的去乙?；?，而其它成員均只有一個催化位點［4-5］。HDAC6在心、肝、腎、腦和胰腺等臟器中呈高表達［2］，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，同時也發(fā)現(xiàn)表達于核周及亞細(xì)胞的生長前沿區(qū)域，與p150粘連蛋白復(fù)合物有關(guān)［6］。已報道，HDAC6在口腔鱗狀細(xì)胞癌、乳腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、卵巢漿液性囊腺癌等多種惡性腫瘤組織中呈高表達［7-11］，本研究中也得出同樣的結(jié)果，HDAC6在SCC組織中的表達顯著高于其在正常皮膚組織中的表達，提示HDAC6的高表達可能在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

大量研究表明，HDAC6可能通過與一些轉(zhuǎn)錄抑制因子在抑癌基因啟動子區(qū)域異常的相互作用，造成抑癌基因表達下降，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。p21WAF1/CIP1基因啟動子區(qū)甲基化或染色質(zhì)中組蛋白去乙?；惓？赡苁菍?dǎo)致該基因轉(zhuǎn)錄受抑制的重要原因［12］。Eun Joo Noh等的［13］研究表明，HDAC抑制劑作用于Hela細(xì)胞時降低細(xì)胞周期蛋白水平，上調(diào)p21WAF1/CIP1的表達，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。另有報道顯示：腫瘤抑制因子（cylindromatosis，CYLD）介導(dǎo)HDAC6的抑制作用能夠降低有絲分裂的速度，延長細(xì)胞周期，CYLD介導(dǎo)HDAC6的抑制作用最終導(dǎo)致核周CYLD的移位，從而抑制Bcl-3在核內(nèi)聚集，阻斷Bcl-3與NF-κB家族p50/p52結(jié)合激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，減少CyclinD1的表達，阻礙細(xì)胞周期G1到S的過渡［14］。為此，本實驗還檢測了細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinD1及p21WAF1/CIP1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達情況。結(jié)果顯示：p21WAF1/CIP1在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達率顯著低于在正常皮膚組織中的；而CyclinD1則在皮膚鱗癌組織中的表達顯著高于其在正常皮膚組織中表達。這可能是因為CyclinD1的過表達及p21WAF1/CIP1的低表達共同作用使細(xì)胞周期調(diào)控失常，導(dǎo)致癌細(xì)胞的無限增殖。通過對HDAC6與p21WAF1/CIP1、CyclinD1的關(guān)聯(lián)性分析，證實HDAC6的過表達與p21WAF1/CIP1的表達降低呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與CyclinD1的過表達呈正相關(guān)關(guān)系。這可能是由于HDAC6可以特異性地結(jié)合p21WAF1/CIP1基因的啟動子區(qū)，直接調(diào)控p21基因的表達，同時對CyclinD1啟動子上游基因座去乙?；种艭yclinD1啟動子，進而調(diào)控細(xì)胞周期進程［15］。抑制HDACs表達可以誘導(dǎo)CDK抑制劑p21WAF1/CIP1的表達，抑制周期素與CDK的活性［15］。HDACs可能通過影響CyclinD1及p21WAF1/CIP1等腫瘤細(xì)胞異常增殖的作用因子而對皮膚鱗狀細(xì)胞癌的增殖分化產(chǎn)生重大影響。

由上可見，HDAC6有望作為臨床治療SCC的新靶點，為HDAC6抑制劑應(yīng)用于SCC的治療提供理論依據(jù)。

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編輯/張惠娟

Expression of HDAC6，p21WAF1/CIP1and CyclinD1 in squamous cell carcinoma of the skin

WU Lei1，DONG Bin1，LI Guang-shuai2，LIU Lin-bo2
（1.Department of Plastic Surgery，Zhengzhou First People's Hospital，Zhengzhou 450004，China；2.Department of Plastic Surgery，The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；）

ObjectiveTo examine the expression of HDAC6，p21WAF1/CIP1and CyclinD1 in the skin squamous cell carcinoma（SCC）tissue.MethodsSP immunohistochemieal staining was used to investigate the expression of HDAC6，p21WAF1/CIP1and CyclinD1 in 40 cases of SCC and 15 cases of normal skin.Results The expression rates of HDAC6（70.0%），CyclinD1（72.5%）in SCC tissue were higher than those of the normal skin（33.3%，40.0%）.The expression rate of p21WAF1/CIP1（32.5%）in SCC lower than the normal skin（66.7%）（P＜0.05）.The expression rate of HDAC6 was correlated with the CyclinD1 expression rate1（r=0.330，P=0.038），The expression rate of HDAC6 was negative correlated with the p21WAF1/CIP1expression rate（r=-0.594，P=0.000）.ConclusionHDAC6 can affect the tumor cell's proliferation and differentiation by influencing p21WAF1/CIP1and CyclinD1，and provide the theory basis of HDAC6 inhibitors used in the treatment of skin squamous cell carcinoma.

Histone deacetylase 6；p21WAF1/CIP1；CyclinD1；Skin squamous cell carcinoma

R739.5

A

1008-6455（2015）15-0034-04

劉林嶓主任醫(yī)師教授博士/碩士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：體表腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究，E-mail：liulinbo@zzu.edu.cn

2015-05-11

2015-07-25