于曉明，楊傳華，陸峰

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011)

·基礎(chǔ)研究·

快律寧膠囊對(duì)外源性自由基所致心律失常的影響△

于曉明1*，楊傳華2，陸峰2

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，江西 南昌 330000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011)

目的：研究快律寧膠囊(KLN)對(duì)外源性自由基所致心律失常的影響，對(duì)比研究KLN與維拉帕米對(duì)其的保護(hù)作用。方法：將SPF級(jí)SD大鼠分為對(duì)照組，維拉帕米組和KLN膠囊高、中、低劑量組，采用Langendoff灌流裝置對(duì)大鼠離體心臟灌注硫酸亞鐵/抗壞血酸的方法，復(fù)制外源性自由基所致大鼠心律失常模型，對(duì)比研究KLN膠囊與維拉帕米對(duì)其的保護(hù)作用。結(jié)果：與對(duì)照組相比，KLN膠囊可以劑量依賴地減少對(duì)外源性自由基所誘發(fā)室性早搏(VEB)、室速(VT)的發(fā)生次數(shù)(P<0.01)；KLN膠囊3個(gè)劑量組及維拉帕米組均未出現(xiàn)室顫(VF)，而對(duì)照組則誘發(fā)出VF，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，KLN膠囊高劑量組心律失常的出現(xiàn)時(shí)間較晚(P<0.05)，而KLN膠囊中低劑量組、維拉帕米組心律失常的出現(xiàn)也有推遲的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與對(duì)照組相比，KLN膠囊3個(gè)劑量組的心率明顯減慢，而且呈劑量相關(guān)性；與對(duì)照組性比，KLN膠囊高、中劑量組的心律失常評(píng)分明顯降低(P<0.05)，而KLN膠囊低劑量組和維拉帕米組則與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：KLN膠囊對(duì)外源性自由基誘發(fā)的心律失?？赡芫哂蓄A(yù)防和治療作用，可以明顯減慢心率，并可能對(duì)惡性心律失常(VT、VF)的發(fā)生具有一定的預(yù)防作用，其療效優(yōu)于維拉帕米。

快律寧；心律失常；外源性自由基；離體藥效學(xué)

心血管疾病是一類威脅人類健康的疾病，其發(fā)病率和死亡率在各類疾病中占首位。而心律失常發(fā)生率在心血管疾病中排在首位，故心律失常的治療就顯得尤為重要。目前臨床上所用的大多數(shù)抗心律失常藥物在治療心律失常的同時(shí)又具有致心律失常作用，或者可引起其他心血管疾病，這使該類藥物的應(yīng)用受到限制。因此開(kāi)發(fā)研究新的抗心律失常藥具有一定的臨床意義。心律失常屬于中醫(yī)“心悸”的范疇，心陰虛火旺是快速型心律失常的重要病機(jī)之一，快律寧(以下簡(jiǎn)稱為KLN)膠囊是在中醫(yī)經(jīng)典理論和治則治法指導(dǎo)下，通過(guò)楊傳華教授多年的臨證經(jīng)驗(yàn)積累，在1994—1999年主持完成山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院立項(xiàng)課題“陰虛火旺型快速型心律失常的臨床證治探討”研究的前提下，逐步形成的山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑。全方由生地、黃連、苦參、當(dāng)歸、酸棗仁、柏子仁組成，可以“清心火、養(yǎng)心陰、安心神”，適用于心陰虛火旺型的心律失常。本研究是在前期“快律寧”復(fù)方有效成分組篩選及安全性評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用KLN膠囊開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷碾x體藥效學(xué)研究。采用Langendoff灌流裝置對(duì)大鼠離體心臟灌注硫酸亞鐵/抗壞血酸的方法，復(fù)制外源性自由基所致大鼠心律失常模型，對(duì)比研究KLN膠囊與維拉帕米對(duì)其的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 主要設(shè)備和儀器

Langendorff 灌流裝置：自制，蠕動(dòng)泵，灌流管道系統(tǒng)，恒溫水循環(huán)裝置，超級(jí)恒溫浴槽(SC-15寧波新芝生物科技股份有限公司)，水壓測(cè)量計(jì)，電子天平(AB-17型號(hào)，瑞士METT LER TOLEDO，精度為0.000 1 g)、超凈工作臺(tái)、防震臺(tái)，玻璃毛坯(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司)；Intel P4，256 MB，40GB計(jì)算機(jī)。BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)+通用放大器(成都泰盟科技有限公司)、常規(guī)手術(shù)器械、注射器。

1.2 主要試劑及其配制

戊巴比妥鈉(分析純，上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)站分裝廠，批號(hào)：96-01-22)：配成3%溶液備用。

肝素鈉(12 500 U/支，天津萬(wàn)邦生化醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：1201115-a)：配成1%溶液備用。

鹽酸普羅帕酮注射液(SIGMA公司，批號(hào)：110401)：加等容積注射用水稀釋。

Krebs-Henseleit緩沖液(mmol·L-1)：NaCl 118，KCl 4.7，MgS04·7H20 1.2，KH2P041.2，NaHC0325.0，CaCl22.5，Glucose 11.0，pH 7.4，滲透壓300 mOsm·L-1)。

KLN膠囊(江蘇江陰藥業(yè)有限公司，0.48 g/粒，批號(hào)：20110920)，以0.9%氯化鈉溶液按設(shè)計(jì)分別稀釋，調(diào)pH至7.40，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，分裝備用。

鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：4E12002)：2 mL∶5 mg。

1.3 動(dòng)物選擇

健康成年SD大鼠(北京維通利華公司，SPF級(jí))30只，雌雄各半，體重240～270 g，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(京)2007·004。

2 方法

2.1 分組方法

按性別和體重，采用隨機(jī)數(shù)字表法等分為5組(n=6)：對(duì)照組、KLN膠囊高劑量組、KLN膠囊中劑量組、KLN膠囊低劑量組、維拉帕米組。

2.2 Langendoff心臟灌流

用2%戊巴比妥鈉0.2 mL·(100 g)-1和1%肝素鈉0.5 mL·(100 g)-1同時(shí)對(duì)大鼠腹腔注射。動(dòng)物麻醉后，取仰臥位固定，開(kāi)胸，在距主動(dòng)脈起始部3～4 mm處取下心臟，迅速放入預(yù)冷0 ℃灌流液中停跳，沖洗心腔和血管內(nèi)的殘留血液后，將心臟迅速移置到Langendoff灌流裝置進(jìn)行非循環(huán)不作功灌流，灌流壓0.82 kPa。灌流液為Krebs-Henseleit緩沖液。灌流前以95%O2+5%CO2混合氣平衡15 min，灌流中持續(xù)通氣。在整個(gè)灌流過(guò)程中，用SC-15型超級(jí)恒溫水浴器使灌流液保持在37 ℃，pH 7.4，冠脈壓力用恒流泵控制在9.8 kPa(100 cmH2O)，灌流過(guò)程中，鉑金電極的兩極分別置于心臟表面的左上及右下角，記錄II導(dǎo)聯(lián)心電圖。

2.3 分組灌流給藥

對(duì)照組：離體心臟預(yù)灌15 min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)持續(xù)灌注30 min，觀察心電圖變化。KLN膠囊的高、中、低劑量組：灌流液中分別加入藥物3、1、0.3 g·L-1，預(yù)灌15 min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)持續(xù)灌注30 min，觀察心電圖變化。維拉帕米組：灌流液中以1 mg·L-1濃度加入維拉帕米預(yù)灌15 min后，灌流液中加入硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)持續(xù)灌注30 min，觀察心電圖變化。

2.4 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

室性早搏(VEB)：指偶發(fā)提前發(fā)生的室性QRS波，包括二聯(lián)律；室速(VT)是連續(xù)4個(gè)(或)以上的VEB；室顫(VF)波幅紊亂且低于正常的QRS波。

心律失常出現(xiàn)時(shí)間(min)：指從灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸開(kāi)始至出現(xiàn)心律失常的時(shí)間。

心率差：指預(yù)灌流K-H液后心電圖穩(wěn)定后的平均心率與灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸30 min后的平均心率的差。

心律失常評(píng)分法：采用Lambeth會(huì)議標(biāo)準(zhǔn)[1]，采用Curtis-Walker法結(jié)合Mest法，在每段觀察時(shí)間內(nèi)取其最嚴(yán)重的1種心律失常相對(duì)應(yīng)的分?jǐn)?shù)作為其心律失常評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)心律失常；1分，房性心律失常，偶發(fā)室性早搏(指1 min內(nèi)發(fā)生3次以下的室性早搏)；2分，頻發(fā)性室性早搏(指1 min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室性早搏)；3分，偶發(fā)性室速(指1 min內(nèi)發(fā)生3次以下的室速)；4分，頻發(fā)性室速(指1 min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室速)或偶發(fā)性室顫(指1 min內(nèi)發(fā)生3次以下的室顫)；5分，頻發(fā)性室顫(指1 min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室顫)或死亡。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心律失常個(gè)數(shù)的比較

由表1可知，灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸后各組大鼠離體心臟均出現(xiàn)不同程度的心律失常，與對(duì)照組相比，KLN膠囊高中低劑量組、維拉帕米組VEB、VT的個(gè)數(shù)明顯減少(P<0.01)，而且呈劑量相關(guān)性，KLN膠囊劑量越高出現(xiàn)VEB、VT的個(gè)數(shù)越少。將KLN膠囊高中低3個(gè)劑量組與維拉帕米組比較，結(jié)果差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。灌流KLN膠囊高中低劑量組、維拉帕米組的大鼠離體心臟均未出現(xiàn)VF，而對(duì)照出現(xiàn)VF，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)生個(gè)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組加入硫酸亞鐵/抗壞血酸30 min內(nèi)出現(xiàn)心律失常個(gè)數(shù)的比較 /個(gè)

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2 心律失常出現(xiàn)時(shí)間、心率差及心律失常評(píng)分的比較

由表2可知，將KLN膠囊高中低劑量組、維拉帕米組分別與對(duì)照組比較，KLN膠囊高劑量組心律失常的出現(xiàn)時(shí)間明顯延遲(P<0.05)，KLN膠囊中低劑量組、維拉帕米組的心律失常出現(xiàn)時(shí)間也有延后的趨勢(shì)，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 心律失常出現(xiàn)時(shí)間、心率差及心律失常評(píng)分的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組在灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后，心率差為負(fù)值，即出現(xiàn)心率加快，而預(yù)灌流KLN膠囊和維拉帕米后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后心率差為正值，即出現(xiàn)心率的減慢，與對(duì)照組的心率差值相比差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且心率差的大小與KLN膠囊劑量呈相關(guān)性，KLN膠囊濃度越高則心率減慢越明顯。

預(yù)灌流KLN膠囊高、中劑量組后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸與對(duì)照組相比，心律失常評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而預(yù)灌流KLN膠囊低劑量組和預(yù)灌流維拉帕米組的心律失常評(píng)分與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

再灌性心律失常的發(fā)生機(jī)制，是國(guó)內(nèi)外心血管研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，但其生化基礎(chǔ)多認(rèn)為與鈣超負(fù)荷和氧自由基的大量產(chǎn)生有關(guān)。氧自由基參與了缺血時(shí)心功能障礙、缺血后心肌“頓挫”和再灌注損傷的病理過(guò)程[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用硫酸亞鐵(0.25 mmol·L-1)/抗壞血酸(1.0 mmol·L-1)作為外源性自由基生成系統(tǒng)，成功復(fù)制出自由基致心律失常的模型。

本實(shí)驗(yàn)灌流液中加入硫酸亞鐵/抗壞血酸后，各組大鼠離體心臟均出現(xiàn)不同程度的心律失常，與對(duì)照組相比，KLN膠囊高、中、低劑量組的VEB、VT個(gè)數(shù)明顯減少(P<0.01)，而且呈劑量相關(guān)性，KLN膠囊劑量越高出現(xiàn)VEB、VT的個(gè)數(shù)越少。灌流KLN膠囊高中低劑量組的大鼠離體心臟均未出現(xiàn)VF，而對(duì)照組出現(xiàn)VF，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。室速、室顫為嚴(yán)重的室性心律失常，是心源性猝死的主要原因之一，因此可以推測(cè)KLN膠囊對(duì)外源性自由基所導(dǎo)致的心律失常，尤其是對(duì)惡性心律失常有很好的預(yù)防作用，而且劑量越高作用越強(qiáng)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)預(yù)灌流KLN膠囊后，與對(duì)照組相比，高劑量組心律失常首次出現(xiàn)時(shí)間明顯延遲，中、低劑量組心律失常首次出現(xiàn)時(shí)間有延遲的趨勢(shì)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。預(yù)灌流KLN膠囊高、中劑量組后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸與對(duì)照組相比，心律失常評(píng)分明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而預(yù)灌流KLN膠囊低劑量組的心律失常評(píng)分則與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此證明KLN膠囊可以劑量依賴性地保護(hù)心臟、預(yù)防或延遲心律失常的發(fā)生。

對(duì)照組在灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后，出現(xiàn)心率明顯加快，用藥前后心率差為負(fù)值，而預(yù)灌流KLN膠囊后再灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后出現(xiàn)心率明顯減慢，用藥前后心率差為正值，與對(duì)照組的心率差值相比差異都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而且心率差的大小與KLN膠囊劑量呈相關(guān)性，KLN膠囊濃度越高則心率減慢越明顯。因此證明KLN膠囊可以劑量依賴性地降低心率。

維拉帕米為選擇性阻滯心肌細(xì)胞膜慢鈣通道，抑制Ca2+內(nèi)流，主要影響竇房結(jié)、房室結(jié)等慢反應(yīng)細(xì)胞?？梢砸种?相緩慢去極化，使自律性降低，心率減慢；降低房室結(jié)0相去極化速度和幅度，使房室傳導(dǎo)速度減慢；使ERP延長(zhǎng)，有利于消除折返。維拉帕米對(duì)室上性和房室結(jié)折返引起的心律失常效果好，陣發(fā)性室上性心動(dòng)過(guò)速的急性發(fā)作已成為首選。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)預(yù)灌流維拉帕米組與對(duì)照組相比心率明顯減慢(P<0.05)，灌流硫酸亞鐵/抗壞血酸后出現(xiàn)VEB、VT、VF的個(gè)數(shù)明顯減少(P<0.01)，心律失常首次出現(xiàn)時(shí)間明顯延遲，由此可證明其有效性。而將KLN膠囊高、中、低3個(gè)劑量組的心律失常個(gè)數(shù)分別與維拉帕米組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而且統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)KLN膠囊高、中劑量組的心律失常評(píng)分要低于維拉帕米組，因此可以推測(cè)KLN膠囊對(duì)外源性自由基所導(dǎo)致的心律失常的預(yù)防作用要優(yōu)于維拉帕米。

現(xiàn)代研究表明，KLN膠囊組方中很多中藥具有清除自由基的作用。當(dāng)歸中的有效成分阿魏酸可直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)以及與生物膜磷脂結(jié)合保護(hù)膜脂質(zhì)等多種機(jī)理拮抗自由基對(duì)組織的損害[5]。黃連所含的小蘗堿具有清除自由基的作用[4]。酸棗仁中所含的脂肪油、酸棗仁皂苷、黃酮類化合物、阿魏酸等具有清除自由基和抗氧化的作用[6]。

鈣超負(fù)荷是自由基致心律失常的另一重要機(jī)制，KLN膠囊組方藥物中的黃連、苦參、生地、當(dāng)歸、酸棗仁均對(duì)鈣通道有阻滯作用，因此推測(cè)KLN膠囊可能具有阻滯鈣通道、抑制鈣超負(fù)荷的作用，從而預(yù)防心律失常的發(fā)生，具有類似IV類抗心律失常藥的特點(diǎn)。

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EffectofFastLawCapsuleonArrhythmiasInducedbyExogenousFreeRadical

YUXiaoming1*，YANGChuanhua2，LUFeng2

(1.AffiliatedHospitalofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330000，China；2.AffiliatedHospitalofShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jinan250011，China)

Objective：To study the effect of the Fast-law Capsules(KLN) on arrhythmias induced by exogenous free radical，and compare the protective effect，between KLN and verapamil.Methods：SPF SD rats were divided into control group，verapamil group and KLN capsules high，medium and low-dose groups，the method of ferrous sulfate/ascorbic acid Langendoff perfusion of isolated rat heart was applied，exogenous free radicals induced arrhythmias in rats was copied.Results：Compared with the control group，KLN capsule showed a dose-dependent reduction in the number of occurrences of exogenous free radicals induced VEB and VT(P<0.01).VF did not occured in KLN capsule three dose groups and verapamil group，while the control group induced VF，but there was no significant difference(P>0.05) by the statistics.Compared with the control group，the emergence of high-dose group time capsule KLN late arrhythmia(P<0.05)，while the KLN capsule low dose group，verapamil group also has delayed the emergence of arrhythmia trend，but after There was no significant statistical difference(P>0.05).Compared with the control group，pulse rate in KLN capsule three dose groups significantly slowed down，and showed a dose-dependent relationship Compared with the control group，KLN capsule high dose group significantly reduced arrhythmia score(P<0.05)，while the low-dose group and KLN capsule verapamil group were no significant differences( Pand the control group>0.05).Conclusion：KLN capsule has an effect on exogenous free radical-induced arrhythmias，and can slow down pulse rate.Its efficacy is superior to verapamil.

Fast-law capsule；arrhythmia；exogenous free radicals；vitro pharmacodynamics

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.009

2014-11-30)

國(guó)家科技重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)課題——抗快速性心律失常中藥候選新藥研究(2009ZX09103-43)

*

于曉明，博士，研究方向：中醫(yī)藥治療心腦系疾??；E-mail：dryxm@163.com