校軍彥，薛艷許，王小敏，劉新月

(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

·中藥工業(yè)·

RP-HPLC同時(shí)測(cè)定健陽(yáng)片中3種成分

校軍彥*，薛艷許，王小敏，劉新月

(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北 石家莊 051430)

目的：建立同時(shí)測(cè)定健陽(yáng)片中甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷3種成分的RP-HPLC方法。方法：Dionex Acclaim C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液；流速為0.8 mL·min-1，梯度洗脫；柱溫為30 ℃。分別對(duì)線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率進(jìn)行考察。結(jié)果：被測(cè)定的3種指標(biāo)成分中甘草苷在0.036 4～0.546 0 μg(r=0.999 8)、甘草酸在0.321 2～4.818 0 μg(r=0.999 7)、淫羊藿苷在0.384 0～5.760 0 μg(r=0.999 9)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率在99.60%～100.76%(RSD≤2.0%)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可為健陽(yáng)片的質(zhì)量控制提供參考。

健陽(yáng)片；高效液相色譜法；甘草苷；甘草酸；淫羊藿苷

健陽(yáng)片收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第八冊(cè)，由蜈蚣粉、淫羊藿提取物粉、甘草提取物粉及蜂王漿4味中藥組成。其作為純中藥制劑具有補(bǔ)腎益精、助陽(yáng)興萎的功能，用于治療腎虛陽(yáng)衰引起的陽(yáng)萎、早泄等性功能低下癥，療效顯著。

原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，僅采用總氮法對(duì)含氮量進(jìn)行控制，對(duì)具有補(bǔ)脾益氣、調(diào)和藥性作用的甘草提取物只有鑒別控制，對(duì)具有補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨功能的淫羊藿提取物沒(méi)有控制。為了更好地控制健陽(yáng)片質(zhì)量，有必要對(duì)原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行升級(jí)。筆者查閱健陽(yáng)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的相關(guān)文獻(xiàn)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)使用HPLC同時(shí)測(cè)定多指標(biāo)成分的相關(guān)報(bào)道，本試驗(yàn)采用梯度洗脫法，首次建立了RP-HPLC同時(shí)測(cè)定甘草苷、甘草酸和淫羊藿苷3種指標(biāo)成分的方法。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，為健陽(yáng)片的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司，包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測(cè)器)；賽托利斯CPA225D電子天平(十萬(wàn)分之一)；舒美KQ300DA型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

甘草苷、甘草酸銨、淫羊藿苷(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為111610-201106，110731-201317，110737-200415)；健陽(yáng)片(神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，規(guī)格：0.64 g，批號(hào)分別為1405152，1405162，1405172，1405182，1405192，1405202)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)；超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dionex Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，按表1規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；流速：0.80 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫條件

2.2 混合對(duì)照品溶液制備

精密稱取對(duì)照品適量，加70%乙醇溶解，配成質(zhì)量濃度分別為0.018 2、0.160 6、0.192 0 mg·mL-1的甘草苷、甘草酸(甘草酸重量=甘草酸銨重量/1.020 7)、淫羊藿苷的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液制備

取本品10片，除去糖衣，精密稱定，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL稱重，超聲處理(功率為250 W，頻率為40 kHz)30 min，放置至室溫，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 空白對(duì)照溶液制備

根據(jù)健陽(yáng)片的生產(chǎn)工藝標(biāo)準(zhǔn)，取蜂王漿、蜈蚣粉以及相關(guān)輔料制得健陽(yáng)片陰性樣品，按照2.3項(xiàng)下方法制得空白對(duì)照溶液。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 按照2.1、2.2、2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果供試品中各待測(cè)成分色譜峰的分離度均大于1.5，對(duì)照品、樣品及空白對(duì)照品的色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.空白對(duì)照品；B.混合對(duì)照品；C.樣品；1.甘草苷；2.淫羊藿苷；3.甘草酸。圖1 健陽(yáng)片及其對(duì)照品高效液相色譜圖

2.5.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液2、5、10、15、20、30 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，甘草苷：Y=36.523 5X+0.096 9，r=0.999 8，線性范圍0.036 4～0.546 0 μg；甘草酸：Y=12.909 1X+0.425 6，r=0.999 7，線性范圍0.321 2～4.818 0 μg；淫羊藿苷：Y=33.337 5X+1.265 8，r=0.999 9，線性范圍0.384 0～5.760 0 μg。結(jié)果表明各化合物在各自的進(jìn)樣范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.46%、0.53%、0.34%，表明精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷峰面積的RSD分別為0.79%、0.74%、0.56%，表明處理后的樣品中各待測(cè)成分在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：1405152)，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷含量分別為0.636 6、2.518 7、4.864 0 mg/片，RSD分別為0.65%、0.67%、0.56%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取6份已知含量的樣品(批號(hào)：1405152)細(xì)粉適量，精密加入適量的甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備所需溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2 甘草苷加樣回收率試驗(yàn)

表3 甘草酸加樣回收率試驗(yàn)

表4 淫羊藿苷加樣回收率試驗(yàn)

2.6 樣品測(cè)定

取6批健陽(yáng)片，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表5。6批樣品批與批之間甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷含量差異較小，可以有效地控制健陽(yáng)片的質(zhì)量。

表5 健陽(yáng)片中指標(biāo)性成分的含量(n=2，mg/片)

3 討論

本次試驗(yàn)比較了甲醇、乙醇、70%乙醇等不同提取溶劑的提取效果，結(jié)果70%乙醇對(duì)甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷提取效率均較高；同時(shí)，考察了超聲提取法、加熱回流提取法，其中超聲提取法提取時(shí)間更短，產(chǎn)率也較高，可在室溫下進(jìn)行，操作方便。故本文選用超聲提取法。

取3個(gè)對(duì)照品的混合溶液和供試品溶液，在200～400 nm進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果在237 nm波長(zhǎng)下，3個(gè)成分均有較大吸收，且該波長(zhǎng)下各成分分離度良好，故確定237 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

由于甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷極性差異較大，等度洗脫難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離，故采用梯度洗脫方式。試驗(yàn)考查了多種流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)分離的影響，結(jié)果乙腈-0.05%磷酸溶液系統(tǒng)梯度洗脫分離效果較好，基線平穩(wěn)，峰形對(duì)稱。

方法學(xué)研究表明，本方法具有良好的精密度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性，能夠同時(shí)測(cè)定甘草苷、甘草酸、淫羊藿苷的含量，可有效地控制健陽(yáng)片的質(zhì)量。

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SimultaneousDeterminationofLiquiritin，GlycyrrhizicAcidandIcariininJianYangTabletsbyRP-HPLC

XIAOJunyan，XUEYanxu，WANGXiaomin，LIUXinyue

(ShinewayPharmaceuticalGroupLtd.，Shijiazhuang，Hebei051430，China)

Objective：To develop an RP-HPLC method for simultaneous determination of liquiritin，glycyrrhizic acid，icariin in Jian Yang Tablets.Methods：The chromatographic separation was achieved on a Dionex Acclaim C18column (250 mm×4.6 mm，5.0 μm) with acetonitrile-0.05% phosphate as mobile phases at the flow rate of 0.8 mL·min-1for gradient elution，and the column temperature was 30 ℃.Its linear relationship，precision，repeatability，stability，and recoveries were investigated.Results：The seven components were well separated and showed good linearity，such as liquiritin 0.036 4-0.546 0 μg(r=0.999 8)，glycyrrhizic acid 0.321 2-4.818 0 μg(r=0.999 7)，icariin 0.384 0-5.760 0 μg(r=0.999 9).The average recoveries were between 99.60% and 100.76% (RSD≤2.0%).Conclusion：The method is simple，accurate and repeatable.It can be applied to the quality control of Jian Yang Tablets.

Jian Yang Tablets；HPLC；liquiritin；glycyrrhizic acid；icariin.

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.019

2015-02-10)

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校軍彥，工程師，研究方向：藥品質(zhì)量控制與檢驗(yàn)；Tel：(0311)88030066-6595，E-mail:swyyxiy@163.com