方香香，謝歡，伍奧林，張壽文*

(1江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西 南昌 330004)

·專題·

霍山石斛快速繁殖技術(shù)研究

方香香1，謝歡2，伍奧林1，張壽文1*

(1江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院，江西 南昌 330004)

以霍山石斛種子為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，篩選霍山石斛種子萌發(fā)、叢生芽增殖及壯苗生根最佳培養(yǎng)基，建立霍山石斛快速繁殖技術(shù)體系。結(jié)果表明，香蕉汁和土豆汁均能促進(jìn)霍山石斛種子萌發(fā)；叢生芽誘導(dǎo)最佳基本培養(yǎng)基和有機(jī)添加物為花寶1號(hào)3 g·L-1和土豆汁；香蕉汁和蛋白胨對(duì)鮮重、生根數(shù)、根長(zhǎng)均沒有產(chǎn)生顯著影響，基本培養(yǎng)基只對(duì)生根數(shù)的影響產(chǎn)生顯著差異，壯苗生根最佳培養(yǎng)基為花寶1號(hào)3 g·L-1+MS(大量元素除外)+香蕉200 g·L-1+蛋白胨0.1 g·L-1。

霍山石斛；種子萌發(fā)；叢生芽；壯苗生根

霍山石斛俗稱米斛，是蘭科石斛屬的草本植物，含多糖、生物堿、氨基酸等物質(zhì)，并含鈣、鉀、鈉、鎂、鋅、鐵、錳、硒、銅、鉻、鎳等微量元素，具有抗腫瘤降血壓提高、抗衰老消除疲勞等功效。因自然繁殖率低，分布范圍狹窄，加上具有重要的藥用價(jià)值，霍山石斛野生資源被過(guò)度采挖而近于滅絕，遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求。為了保護(hù)和發(fā)展這一資源，霍山石斛人工大規(guī)模繁殖是必然的發(fā)展趨勢(shì)。目前運(yùn)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)培育試管苗進(jìn)行人工栽培已成為市場(chǎng)供求主體。本研究旨在研究霍山石斛快速繁殖技術(shù)，為霍山石斛的規(guī)?；N植優(yōu)質(zhì)種苗的獲取提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)的材料為霍山石斛未成熟開裂的蒴果，采自江西省九江市修水縣石斛種植基地，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)賴學(xué)文教授鑒定為蘭科植物石斛屬霍山石斛的蒴果。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā) 設(shè)計(jì)4組不同培養(yǎng)基①M(fèi)S；②MS+NAA1.0 mg·L-1；③MS+土豆200 g·L-1/L；④MS+香蕉200 g·L-1；考察霍山石斛種子萌發(fā)情況。

1.2.2 叢生芽增殖 采用MS、1/2 MS、KC、花寶1號(hào)3 g·L-1四種基本培養(yǎng)基，考察基本培養(yǎng)基對(duì)對(duì)霍山石斛叢生芽增殖的影響；以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，分別添加香蕉100 g·L-1、土豆100 g·L-1、水解乳蛋白0.5 g·L-1、酸水解酪蛋白0.5 g·L-1，考察不同添加物對(duì)霍山石斛叢生芽增殖的影響。各組培養(yǎng)基中均添加激素6-BA 1.0 mg·L-1、NAA0.5 mg·L-1、KT1.0 mg·L-1[1]。

1.2.3 壯苗生根 選擇基本培養(yǎng)基、香蕉、蛋白胨這三個(gè)因素，每個(gè)因素三個(gè)水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，選擇L9(34)正交表第1、2、4列，考察以上3個(gè)因素對(duì)壯苗生根的影響，因素與水平見表1。各組均添加活性炭0.5 g·L-1。

表1 正交試驗(yàn)L9(34)因素與水平表

1.2.4 試驗(yàn)條件與結(jié)果統(tǒng)計(jì) 以上所有培養(yǎng)基均添加蔗糖20 g·L-1、瓊脂5.6～5.8 g·L-1，PH值6.0左右。各試驗(yàn)組每組5瓶，每瓶接種試管苗5株，(23±2) ℃，光照時(shí)間24 h·d-1，光照強(qiáng)度1200～1600 lx，培養(yǎng)兩個(gè)月后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

叢生芽增殖系數(shù)=增殖后總芽數(shù)/接種總芽數(shù)，鮮重增殖系數(shù)=增加鮮重/接種時(shí)鮮重

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響

接種兩周后，各試驗(yàn)組種子開始由米黃色逐漸轉(zhuǎn)變成黃綠色，1個(gè)月后轉(zhuǎn)為綠色。培養(yǎng)2個(gè)月統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。由表2可以看出霍山石斛種子無(wú)菌萌發(fā)率很高，香蕉汁和土豆汁有助于提高種子萌發(fā)率，NAA對(duì)種子萌發(fā)的影響不大。各試驗(yàn)組的種胚萌發(fā)形成原球莖之后一定時(shí)間內(nèi)在各組培養(yǎng)基中均能良好生長(zhǎng)，但在第3個(gè)月時(shí)，①和②培養(yǎng)基的原球莖開始逐漸白化，最后全部白化死亡；添加香蕉汁組的原球莖雖然飽滿顏色較深，但在70 d之后原球莖顏色逐漸變淺形成黃綠色，部分白化死亡；添加土豆汁組的原球莖生長(zhǎng)最好，不僅飽滿深綠，沒有白化現(xiàn)象，部分還分化出一片鞘葉。

表2 霍山石斛種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

2.2 基本培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖的影響

由表3可以看出這四種基本培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖的影響有所不同。KC組的增殖系數(shù)最大，與其他3組之間存在顯著差異，新生芽長(zhǎng)KC組與1/2 MS和MS組之間也存在顯著差異，但是KC基本培養(yǎng)基組小苗部分出現(xiàn)畸形且顏色淺綠，不如其他3組的試管苗長(zhǎng)得好?；▽?號(hào)3 g·L-1組的叢生芽增殖與新生芽的生長(zhǎng)都優(yōu)于1/2 MS和MS組，試管苗生長(zhǎng)狀況良好且有根生成。因此，霍山石斛試管苗叢生芽增殖的適宜基本培養(yǎng)基是花寶1號(hào)3 g·L-1。

表3 基本培養(yǎng)基對(duì)叢生芽增殖的影響(n=3)

注：表中多重比較相同字母代表差異不顯著

2.3 添加物對(duì)叢生芽增殖的影響

表4結(jié)果顯示各添加物對(duì)叢生芽的誘導(dǎo)沒有明顯的作用，新生芽雖然有所增高，但是增高不是很多。香蕉組試管苗顏色濃綠，較其他組深，部分已經(jīng)生根，但莖葉細(xì)長(zhǎng)；酸水解酪蛋白、水解乳蛋白和土豆促使小苗莖葉粗壯，水解乳蛋白還能誘導(dǎo)小苗生根，但土豆組新生芽較其他組都高，因此土豆是霍山石斛叢生芽增殖的最佳添加物。

表4 添加物對(duì)叢生芽增殖的影響(n=3)

2.4 基本培養(yǎng)基、香蕉、蛋白胨對(duì)壯苗生根的影響

表5結(jié)果表明，不同處理組的試管苗生長(zhǎng)狀況存在差異，基本培養(yǎng)基、香蕉、蛋白胨對(duì)霍山石斛試管苗鮮重、生根數(shù)、根長(zhǎng)均有不同程度的影響。鮮重增殖系數(shù)方差分析表6顯示，各因素對(duì)霍山石斛鮮重增殖影響的順序?yàn)橄憬?蛋白胨>基本培養(yǎng)基，但均未對(duì)鮮重產(chǎn)生顯著影響。根長(zhǎng)方差分析表7顯示，各因素對(duì)霍山石斛根長(zhǎng)影響的順序?yàn)橄憬?蛋白胨>基本培養(yǎng)基，3個(gè)因素同樣未產(chǎn)生顯著影響。生根數(shù)方差分析表8表明，影響霍山石斛生根數(shù)順序?yàn)榛九囵B(yǎng)基>香蕉>蛋白胨，香蕉和蛋白胨在本試驗(yàn)的條件下對(duì)生根數(shù)未產(chǎn)生顯著影響，但基本培養(yǎng)基對(duì)霍山石斛生根數(shù)的影響存在顯著差異(P=0.028<0.05)。

表5 霍山石斛壯苗生根L9(33)正交試驗(yàn)直觀分析(n=3)

本著經(jīng)濟(jì)節(jié)約的原則，影響未達(dá)到顯著水平的因素選擇成本最少的水平?；九囵B(yǎng)基雖對(duì)鮮重增殖和根長(zhǎng)未產(chǎn)生顯著影響，但對(duì)生根數(shù)產(chǎn)生顯著影響，表5中的直觀分析中基本培養(yǎng)基水平2對(duì)生根數(shù)影響最大，因此基本培養(yǎng)基以水平2為宜。香蕉雖然對(duì)3個(gè)考察指標(biāo)的影響均沒有達(dá)到顯著水平，但是在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)第7、8、9組的小苗較其他6組小苗高，且水平3對(duì)3個(gè)考察指標(biāo)影響最大，因此香蕉汁以水平3為宜。蛋白胨在壯苗生根過(guò)程中的促進(jìn)作用不如香蕉和基本培養(yǎng)這兩個(gè)因素，以蛋白胨以水平1為宜?；羯绞鷫衙缟罴雅囵B(yǎng)基為花寶1號(hào)3 g·L-1+MS(大量元素除外)+香蕉200 g·L-1+蛋白胨0.1 g·L-1。

表6 鮮重增殖系數(shù)方差分析

表7 根長(zhǎng)方差分析

表8 生根數(shù)方差分析

3 討論

在植物組織培養(yǎng)中常常會(huì)添加一些有機(jī)添加物，如香蕉汁、土豆汁、椰汁、水解酪蛋白、蛋白胨[6]等[2-6]，這些有機(jī)添加物成分比較復(fù)雜，大多含氨基酸、激素、酶等一些復(fù)雜化合物，對(duì)細(xì)胞和組織的增殖與分化有明顯的促進(jìn)作用[7]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)土豆汁、香蕉汁對(duì)霍山石斛種子萌發(fā)形成原球莖具有較好的促進(jìn)作用，但是香蕉汁對(duì)原球莖的生長(zhǎng)不利，這與劉道敏等[8]的報(bào)道是一致的。香蕉汁與土豆汁對(duì)試管苗的生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用[9]，但香蕉汁則促進(jìn)生根效果更明顯，且試管苗葉色濃綠。錢文林[10]、謝寅峰[9]、石瑋[11]等人的研究結(jié)果表明，香蕉能很好的促進(jìn)霍山石斛試管苗生長(zhǎng)，增殖鮮重，促進(jìn)生根，本試驗(yàn)的結(jié)果也驗(yàn)證了以上結(jié)論，但香蕉對(duì)鮮重增殖、生根數(shù)及根長(zhǎng)的影響均未達(dá)到顯著水平，可能是水平設(shè)計(jì)不合理所致。蛋白胨雖然對(duì)壯苗生根階段考察的3個(gè)指標(biāo)的影響沒有達(dá)到顯著水平，但是試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，添加蛋白胨組均比沒有添加蛋白胨組試管苗的顏色深、根粗。

叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)中增殖系數(shù)及新生芽長(zhǎng)以KC組最高，MS組最低。許多研究報(bào)道表明低濃度的無(wú)機(jī)鹽更有利于植物的生長(zhǎng)[12-13]。KC基本培養(yǎng)基組成比較簡(jiǎn)單，礦質(zhì)元素含量相對(duì)較低，使培養(yǎng)基滲透壓降低，更有利于植物吸收養(yǎng)分。但是KC培養(yǎng)基只含有礦質(zhì)元素，成分簡(jiǎn)單，無(wú)法滿足植物生長(zhǎng)的需要，試管苗逐漸變黃甚至畸形。

霍山石斛規(guī)?；a(chǎn)中，試管苗的獲取已不再是難題[14-15]，但是優(yōu)質(zhì)的試管苗能夠提高移栽存活率，節(jié)約生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益。本試驗(yàn)種子無(wú)菌萌發(fā)獲得的試管苗經(jīng)壯苗生根后，葉色濃綠，莖粗根長(zhǎng)，在幾種不同組合的基質(zhì)中移栽兩個(gè)月后均能較好生長(zhǎng)。

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StudyonRapidPropagationofDendrobiumhuoshanense

FANGXiangxiang1，XIEHuan2，WUAolin1，ZHANGShouwen1*

(1.JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004； 2.ScienceandTechnologyCollegeofJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330004)

The seeds ofDendrobiumhuoshanensewere used as explants，and seed germination，culture medium，multiple shoot clumps proliferation seeding roots by tissue culturewas were screened in order to establish a rapid reproduction technology system forD.huoshanense.The results suggested that babana and potato juice could protect seed germination.Hyponex No.1 and potato juice were the optimal basic medium and organic susbstance of multiple shoot clumps proliferation，respectively.Banana juice and peptone had not significant effect on fresh weight，root number and root length.The basic culture medium had significant influence only on the root number.The optimal culture medium of seedling root was 3 g·L-1Hyponex No.1+MS (except for a large number of elements) + 200 g·L-1banana + 0.1 g·L-1peptone.

Dendrobiumhuoshanense；seed germination；multiple shoot clumps proliferation；seeding roots

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.6.003

2014-11-03)

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張壽文，教授，研究方向：中藥資源保護(hù)與開發(fā)；Tel：(0791)87118994，E-mail：hero220@163.com