潘慧敏，姜保平，樂亮，肖偉，許利嘉*，肖培根

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193； 2.國家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193)

·健康產(chǎn)業(yè)·

藤茶主要成分對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響△

潘慧敏1，2，姜保平1，2，樂亮1，肖偉1，2，許利嘉1，2*，肖培根1，2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所 北京 100193； 2.國家教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193)

目的：探討藤茶主要成分，二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素及楊梅苷對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖消耗及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、乳酸(LD)、三磷酸腺苷(ATP)含量以及超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性的影響。方法：將HepG2細(xì)胞分為正常對(duì)照組、胰島素抵抗模型組和樣品干預(yù)組。用高糖(55 mmol·L-1)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，建立胰島素抵抗模型，用MTT法檢測(cè)樣品對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響；用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)上清中葡萄糖的含量；用分光光度法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDA、LD含量及SOD、CAT活性；用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS和ATP水平。結(jié)果：五個(gè)化合物在有效濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞增殖無顯著影響；樣品干預(yù)組葡萄糖消耗量較模型組顯著升高；與模型組相比，五個(gè)化合物某個(gè)或某幾個(gè)濃度組顯著降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量，提高SOD、CAT活性及ATP水平；沒食子酸、二氫槲皮素和楊梅苷顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平；除二氫楊梅素外，其余四個(gè)化合物均能降低細(xì)胞內(nèi)LD含量。結(jié)論：胰島素抵抗HepG2細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞相比有較高的氧化應(yīng)激水平，抗氧化能力減弱。藤茶主要成分能通過降低細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，增加細(xì)胞的抗氧化能力，從而預(yù)防胰島素抵抗。

藤茶；HepG2細(xì)胞；胰島素抵抗；氧化應(yīng)激

胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)是指機(jī)體對(duì)一定量胰島素的生物學(xué)反應(yīng)低于預(yù)計(jì)正常水平的一種現(xiàn)象，也就是機(jī)體對(duì)胰島素的反應(yīng)減退。胰島素抵抗被認(rèn)為是糖尿病、肥胖、脂代謝紊亂等慢性代謝性疾病的共同的生理病理學(xué)基礎(chǔ)[1]，因此對(duì)于胰島素抵抗發(fā)生機(jī)制的研究具有非常重要的意義。

多種致病因素如高血糖、高游離脂肪酸血癥以及促炎因子分泌增加均可導(dǎo)致胰島素抵抗。研究表明，上述因素導(dǎo)致胰島素敏感性下降的共同機(jī)制之一是促進(jìn)機(jī)體的氧化應(yīng)激[2-3]。氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)活性氧(ROS)的生成增加和(或)清除能力降低，導(dǎo)致ROS的生成和清除失衡。ROS具有重要的生理作用，但過量則引起分子、細(xì)胞和機(jī)體的損傷[4-5]，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA、LD含量升高，SOD、CAT活性下降[6]，ATP水平降低[7]。大量研究表明，胰島素抵抗的發(fā)生與機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)有著密不可分的關(guān)系，過多的氧自由基促發(fā)胰島素抵抗，而胰島素抵抗又反過來加重氧化應(yīng)激[8]。機(jī)體氧化應(yīng)激水平越高，抗氧化防御能力越弱，胰島素抵抗的程度就越高。因此，降低高血糖細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平，是改善細(xì)胞胰島素抵抗的途徑之一。

藤茶，系葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄Ampelosisgrossedentata(Hand.-Mazz)W.T.Wang的嫩莖葉[9]，是中國民間流傳已久的古茶。文獻(xiàn)報(bào)道，藤茶具有顯著的抗氧化活性[10]。前期研究發(fā)現(xiàn)，藤茶具有顯著的預(yù)防胰島素抵抗的活性。藤茶總黃酮及二氫楊梅素能夠明顯降低高脂飲食大鼠的血脂水平，對(duì)多種動(dòng)物模型有明顯的降低血糖的作用，而對(duì)正常小鼠血糖無明顯影響[11-12]。然而，藤茶是否能通過改善氧化應(yīng)激水平而預(yù)防胰島素抵抗，這方面的研究至今尚無報(bào)道。

二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素及楊梅苷為藤茶中的主要成分，其中以二氫楊梅素含量最高。本實(shí)驗(yàn)首次研究了藤茶主要成分對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖消耗、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、乳酸(lactic acid，LD)、三磷酸腺苷(adenosine 5’-triphosphate，ATP)的影響，探討藤茶預(yù)防胰島素抵抗的物質(zhì)基礎(chǔ)及可能的作用機(jī)制，為藤茶的深度開發(fā)，資源進(jìn)一步的充分利用，提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

DL-CJ-IND-Ⅱ超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；3100型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Thermo Forma公司；CKX41倒置顯微鏡：日本Olympus公司；Fluoroskan Ascent FL型熒光/化學(xué)發(fā)光分析儀：美國Thermo Forma公司；MQX200型酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；

1.2 試劑

DMEM低糖培養(yǎng)基：HyClone公司；胎牛血清：美國Gibco公司；青-鏈霉素：HyClone公司；0.25%胰蛋白酶：美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四氮甲唑藍(lán)(MTT)：美國Sigma公司；牛胰島素：美國Sigma公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒：北京普利萊基因技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶檢測(cè)試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所；乳酸測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所；活性氧檢測(cè)試劑盒、脂質(zhì)氧化檢測(cè)試劑盒、過氧化氫檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：碧云天生物技術(shù)研究所。其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 材料

HepG2細(xì)胞株：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所；二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 HepG2胰島素抵抗細(xì)胞模型的建立

根據(jù)文獻(xiàn)方法[13]加以改進(jìn)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基稀釋，以105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼壁后，棄去上清液，加入新鮮配制的不同濃度的高糖溶液100 μL/孔繼續(xù)于37 ℃，5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同的時(shí)間，用預(yù)熱的PBS沖洗2遍后，用1 nmol·L-1胰島素刺激15 min，葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清的葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗量。最終選定以55 mmol·L-1的高糖溶液作用24 h建立胰島素抵抗模型。

2.2 藤茶主要成分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組和樣品干預(yù)組，樣品干預(yù)組換無血清的含藥培養(yǎng)基，樣品終劑量分別為二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1、200 μmol·L-1、300 μmol·L-1及400 μmol·L-1，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，加藥24 h后，移出培養(yǎng)液，將5 mg·mL-1的MTT原液與無血清DMEM培養(yǎng)基按體積比1∶>9配成MTT溶液，每孔加入100 μL，4 h后換二甲基亞砜，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值。

2.3 藤茶主要成分對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖消耗的影響

根據(jù)文獻(xiàn)方法[13]加以改進(jìn)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組及樣品干預(yù)組。樣品干預(yù)組換無血清的含藥培養(yǎng)基，樣品終劑量分別為二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1及40 μmol·L-1，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，加藥24 h后，上述各組(除空白對(duì)照組)再分別加高糖(55 mmol·L-1)處理24 h后。各組細(xì)胞用預(yù)熱的PBS沖洗2遍，用1 nmol·L-1胰島素刺激15 min，用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清的葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖消耗量。

2.4 藤茶主要成分生化指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)方法[13]加以改進(jìn)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以105個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。將細(xì)胞分為正常對(duì)照組、模型組及樣品干預(yù)組。樣品干預(yù)組換無血清的含藥培養(yǎng)基，樣品終劑量分別為二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素、楊梅苷：5 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20及40 μmol·L-1，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，加藥24 h后，上述各組(除空白對(duì)照組)再分別加高糖(55 mmol·L-1)處理24 h后。收集細(xì)胞，按照試劑盒方法處理細(xì)胞樣品并測(cè)定ROS、MDA、SOD、CAT、LD、ATP水平。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果均以±s形式表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析，組內(nèi)比較采用Duncan’ s檢驗(yàn)，P<0.05有顯著性差異。

3 結(jié)果

3.1 藤茶主要成分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖1 藤茶主要成分對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響

圖1表明，五個(gè)化合物濃度在100 μmol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞存活率均接近100%，對(duì)細(xì)胞增殖無顯著影響。當(dāng)樣品濃度增大到150 μmol·L-1時(shí)，二氫楊梅素、二氫槲皮素、楊梅素才開始對(duì)細(xì)胞增殖起到抑制作用。

3.2 藤茶主要成分對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞糖消耗影響

如表1所示，模型組細(xì)胞糖消耗量明顯低于正常對(duì)照組(P<0.01)，說明建模成功。用藤茶各部位預(yù)處理24 h后，再給予高糖刺激，與模型組相比，除楊梅素5 μmol·L-1、10 μmol·L-1和40 μmol·L-1組外，其余各化合物各個(gè)濃度組均能不同程度的促進(jìn)HepG2細(xì)胞糖消耗。

3.3 藤茶主要成分對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、SOD、CAT、LD和ATP水平的影響

由表2可知，模型組ROS、MDA、LD含量較正常對(duì)照組顯著升高，SOD、CAT活性及ATP水平與正常對(duì)照組相比顯著降低。與模型組相比，沒食子酸、二氫槲皮素及楊梅苷(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)處理后ROS含量顯著降低；二氫楊梅素和二氫槲皮素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、沒食子酸(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、楊梅素及楊梅苷各濃度組MDA含量也明顯下降；與此同時(shí)，二氫楊梅素和楊梅苷(10μmol·L-1、20μmol·L-1、40 μmol·L-1)、沒食子酸和楊梅素(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)及二氫槲皮素各濃度組SOD活性較模型組有顯著提高；二氫楊梅素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1)、楊梅素(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)、沒食子酸、二氫槲皮素及楊梅苷各濃度組的CAT活性也顯著上升；沒食子酸和二氫槲皮各濃度組、楊梅素(40 μmol·L-1)及楊梅苷(20 μmol·L-1)LD含量顯著降低；二氫楊梅素和沒食子酸各濃度組、二氫槲皮素和楊梅素(20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)及楊梅苷(10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、40 μmol·L-1)ATP含量顯著升高。

表1 藤茶主要成分對(duì)IR-HepG2細(xì)胞糖消耗影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與正常對(duì)照組相比，##P<0.01。

表2 藤茶主要成分對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA、SOD、CAT、LD和ATP水平的影響

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01；與正常對(duì)照組相比，##P<0.01。

4 結(jié)論

機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高；MDA作為脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映細(xì)胞氧化損傷程度；而體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，如SOD、CAT等則能減少氧自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，它們活性的高低反映機(jī)體的抗氧化能力[6]。胰島素抵抗引起細(xì)胞內(nèi)葡萄糖無氧酵解的過程增強(qiáng)，乳酸生成增加。乳酸在細(xì)胞內(nèi)積聚，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞滲透壓增高，線粒體腫脹和破裂，影響線粒體呼吸功能而發(fā)生能量代謝障礙。高糖使細(xì)胞內(nèi)乳酸和氧自由基與脂質(zhì)過氧化物生成增加，又會(huì)損傷線粒體的能量代謝，細(xì)胞內(nèi)ATP水平下降[14，15]。本實(shí)驗(yàn)以高糖誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，結(jié)果表明，在有效濃度范圍內(nèi)，各樣品對(duì)細(xì)胞存活率無顯著影響。高糖可以引起細(xì)胞內(nèi)ROS、MDA水平增高，SOD、CAT活性下降，其氧化/抗氧化體系的穩(wěn)態(tài)失衡，而沒食子酸、二氫槲皮素和楊梅苷能顯著降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，二氫楊梅素、沒食子酸、二氫槲皮素、楊梅素和楊梅苷均能明顯增加胰島素抵抗HepG2細(xì)胞SOD、CAT的活性，降低MDA水平。本研究經(jīng)過高糖造模后，細(xì)胞內(nèi)液乳酸含量明顯增加，而損傷前給予供試樣品預(yù)處理可抑制乳酸含量的增加。

以上研究結(jié)果提示藤茶可能通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及提高細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性來減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷，增加細(xì)胞的抗氧化功能，減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激，從而預(yù)防胰島素抵抗。同時(shí)，可能也與減輕細(xì)胞代謝性酸中毒，提高ATP水平，改善細(xì)胞能量代謝有關(guān)。

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EffectsofmaincompoundsfromAmpelosisgrossedentataonoxidativestressininsulin-resistantHepG2cells

PANHuimin1，2，JIANGBaoping1，2，LELiang1，XIAOWei1，2，XULijia1，2*，XIAOPeigen1，2

(1.InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100093，China； 2.KeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandResourcesUtilizationofChineseHerbalMedicine，MinistryofEducation，Beijing100193，China)

Objective：To investigate the influence of the main compounds：dihydromyricetin，gallic acid，dihydroquercetin，myricetin and myricitrin fromAmpelopsisgrossedentataon glucose consumption，ROS，MAD，SOD，CAT，LD and ATP in insulin-resistant HepG2 cells.Methods：HepG2 cells were divided into control group，model group and sample groups.Insulin-resistant cells model was induced by high concentration of glucose (55 mmol·L-1).The proliferation of cells were detected by 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenylterazolium bromide (MTT) assay.The contents of glucose in culture supematant were measured by the glucose oxidase peroxides (GOD) method. The contents of MDA，SOD，CAT and LD were observed by spectrophotometric method.The contents of ROS and ATP were analyzed on a fluorescence microplate.Results：The five compounds had little impact on the cells proliferation within the range of effective concentration.The five compounds increased the glucose consumption significantly in insulin-resistant cells.After treated with the five compounds，the contents of SOD，CAT and ATP increased significantly，while that of MDA decreased.Dihydroquercetin，gallic acid and myricitrin were able to reduce the contents of ROS and LD significantly.Meanwhile，the content of LD also could be reduced significantly by myricetin.Conclusion：Dihydromyricetin，gallic acid，dihydroquercetin，myricetin and myricitrin fromA.grossedentatacan alleviate oxidative stress in the insulin-resistant HepG2 cells.

Ampelosisgrossedentata；HepG2 cells；insulin-resistant；oxidative stress

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.019

2015-01-07)

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81274188)：四種別樣茶改善胰島素抵抗的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究

*

許利嘉，副研究員，博士，研究方向：別樣茶的物質(zhì)基礎(chǔ)研究；TEL：010-57833165 E-mail：xulijia@hotmail.com