林宏英，蘇暢，段天璇，黃建梅，孫毅坤，王玥，冀嬌嬌，董潔，劉永剛*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京鑫康辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司，北京 100048)

·基礎(chǔ)研究·

基于HPLC/ESI-MS技術(shù)的川烏加熱前后化學(xué)成分變化△

林宏英1，蘇暢2，段天璇1，黃建梅1，孫毅坤1，王玥1，冀嬌嬌1，董潔1，劉永剛1*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；2.北京鑫康辰醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司，北京 100048)

目的：研究川烏在加熱前后生物堿變化。方法：采用LC-MS測定方法，Agilent Zorbax Extend-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫為30 ℃；流動相為醋酸銨(氨水調(diào)pH 8)-乙腈(20 mmol·L-1)；流速為1.0 mL·min-1；質(zhì)譜采用正離子檢測模式。結(jié)果：分析鑒定了川烏中13個生物堿類成分，其中9個生物堿在加熱過程中的變化較明顯。結(jié)論：本方法簡便，具有較高的準(zhǔn)確度和精密度，可用于生物堿變化的分析。

川烏；液質(zhì)聯(lián)用；成分變化

川烏為常用中藥，是毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的干燥母根，主產(chǎn)于四川江油、平武、綿陽，陜西城固、戶縣、南鄭等地。具有回陽救逆、溫中補(bǔ)腎、散寒止痛等功能，用于風(fēng)寒濕痹，關(guān)節(jié)及筋骨疼痛，頭風(fēng)疼痛，半身不遂，寒疝腹痛，陰疽腫毒等證[1]。從漢代張仲景的《金匱要略》出現(xiàn)烏頭的炮制方法起，演變至今已有約70多種炮制方法，主要有鹽炙川烏、酒炙川烏和川烏炭等。一直以來，對川烏的炮制研究主要集中在烏頭堿等3種雙酯型生物堿的變化上[2-6]，由于方法的限制，所得到的信息不夠全面，具有一定的局限性。本試驗(yàn)采用HPLC/ESI-MS技術(shù)對川烏加熱不同時間的化學(xué)成分進(jìn)行了全面的研究，闡明了川烏經(jīng)炮制后化學(xué)成分的量變和質(zhì)變。該方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為中藥材的炮制研究提供了新思路和新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜-電噴霧離子源-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-ESI-MS，美國Thermo Fisher公司)；電子天平(BSA124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；pH計(PHS-W系列，上海般特儀器有限公司)；超聲波清洗器(KQ32OO型，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

烏頭堿對照品、新烏頭堿對照品、次烏頭堿對照品、苯甲酰烏頭堿對照品、苯甲酰新烏頭堿對照品、苯甲酰次烏頭堿對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110720-201111，110798-201106，110799-201106，111794-201102，111795-201002，111796-201002)；乙腈(色譜純，美國MREDA TECHNOLOGY INC)；醋酸銨(分析純，Sigma-Aldrich公司)；氨水(分析純，北化精細(xì)化工有限公司)；水為純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)公司)；川烏藥材(四川江油中壩附子科技發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

取烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿6種對照品適量，加甲醇溶解，作為對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取生川烏藥材粉碎，精密稱取10 g，2份，分別置于500 mL的燒瓶中，各加水500 mL。其中1份加熱回流提取，保持微沸，分別于10、30、60、90、120、150、180 min取樣，每次取1 mL，再加1 mL水補(bǔ)足減失的重量。色譜圖見圖1。

A.加熱10 min；B.加熱30 min；C.加熱60 min；D.加熱90 min；E.加熱120 min；F.加熱150 min；G.加熱180 min。圖1 加熱不同時間的總離子流色譜圖

2.3 分析條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(20 mmol·L-1)-醋酸銨(pH=8)，梯度洗脫：0～40 min，15%～30%乙腈，40～70 min，30%～60%乙腈；進(jìn)樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；流速為1.0 mL·min-1。

2.3.2 質(zhì)譜條件 正離子檢測模式。噴霧電壓(Spray Voltage)為3000 V；離子傳輸管溫度為350 ℃；蒸發(fā)器溫度(Vaporizer Temperature)為250 ℃；鞘氣壓力(Sheath Gas Pressure)為30 arb；輔助氣壓力(Aux Gas Pressure)為10 arb；采用全掃描(Full Scan)、二級全掃描(MS2)，全掃描質(zhì)量范圍(m/z)為100～1200；MS2碰撞氣為氬氣；分流進(jìn)樣，分流比為4∶1。

3 結(jié)果

3.1 生物堿的鑒定

準(zhǔn)分子[M+H]+烏頭類生物堿在陽離子模式下很容易檢測到[7]，這在本試驗(yàn)中也得到了進(jìn)一步的證實(shí)。通過對LC-MS檢測結(jié)果的分析，在川烏加熱提取中除了雙酯型生物堿外，還檢測到多種化合物，其準(zhǔn)分子離子m/z分別為486、500、470、590、604、572、574、586和556，結(jié)合其MS2譜特征離子，推測其對應(yīng)的化合物分別為中烏頭原堿、烏頭原堿、次烏頭原堿、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、焦中烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、焦烏頭堿、焦烏頭次堿，其中中烏頭原堿、烏頭原堿、次

烏頭原堿、中烏頭次堿、烏頭次堿和次烏頭次堿6個化合物分別為中烏頭堿、次烏頭堿和烏頭堿水解產(chǎn)物。相應(yīng)的碎片離子見表1。另外，結(jié)合參考文獻(xiàn)[7]，又鑒定了4個生物堿，分別為去氧次烏頭原堿、塔拉胺、Karakolidine和尼奧靈。結(jié)合文獻(xiàn)[8]報導(dǎo)，推斷焦烏頭堿、焦烏頭次堿和焦中烏頭堿為熱解產(chǎn)物。

表1 13個化合物的MS2裂解特征

3.2 9個生物堿的含量變化

通過分析不同加熱時間不同產(chǎn)物的峰面積，加熱時間分別為10、30、60、90、120、150、180 min。9個化合物峰面積發(fā)生了明顯改變，其變化曲線見圖2。

圖2 9個化合物峰面積變化的加熱曲線圖

4 討論

在化合物液相分離過程中，流動相選擇對試驗(yàn)起著關(guān)鍵性的作用。本試驗(yàn)使用的流動相為乙腈(20 mmol·L-1)-醋酸銨，醋酸銨用氨水調(diào)pH至8.0～8.4。流動相PH值對結(jié)果影響較大，試驗(yàn)過程中應(yīng)注意控制PH值。

本試驗(yàn)采用先進(jìn)的HPLC/ESI-MS技術(shù)對川烏加熱前后的化學(xué)成分進(jìn)行了全面系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)川烏經(jīng)炮制后不但有已知成分量的變化，而且還有內(nèi)在成分質(zhì)的改變。這些炮制后新產(chǎn)生的組分以及發(fā)生量變的組分極有可能是川烏炮制后功能改變的物質(zhì)基礎(chǔ)，但是僅靠質(zhì)譜分析并不能確定這些未知物質(zhì)的準(zhǔn)確結(jié)構(gòu)，需要借助其他手段做進(jìn)一步研究。

川烏炮制后化學(xué)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)有的增加，有的減少，很可能是某些成分在炮制過程中發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成了其他的成分。在試驗(yàn)過程中筆者發(fā)現(xiàn)，隨著炮制時間延長，烏頭堿等雙酯堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減少，而單酯型生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加，到一定時間后逐漸減少，焦烏頭堿也呈現(xiàn)此規(guī)律。因此，推測烏頭堿在加熱過程中發(fā)生了兩種反應(yīng)，一種是水解過程，由于酯水解過程需要水的參與；而生成焦烏頭堿的過程中不需要水的參與，故推測為熱解反應(yīng)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：36-37.

[2] 王勇，劉淑瑩.烏頭堿類生物堿的質(zhì)譜研究進(jìn)展[J].質(zhì)譜學(xué)報，2002，23(2)：112-119.

[3] 李正邦，呂光華，陳東林，等.草烏中生物堿的化學(xué)研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1997，9(1)：91.

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[5] 高黎明，鄭尚珍，沈序維，等.烏頭屬植物中二萜生物堿研究進(jìn)展[J].西北師范大學(xué)學(xué)報，1999，35(2)：109-116.

[6] 王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學(xué)[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社，1997.

[7] Hu R，Zhao J，Qi L W，et al.Structural characterization and identification of C19-and C20-diterpenoid alkaloids in roots of Aconitum carmichaeli by rapid-resolution liquid chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom，2009，23(11)：1619-1635.

[8] 王峰峰，宋兆輝，張?zhí)m蘭，等.烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿水解和醇解產(chǎn)物的研究[J].中國中藥雜志，2012，37(11)：1564-1569.

中國植物學(xué)會第十三屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會

暨2015年海峽兩岸中醫(yī)藥科學(xué)交流會

第一輪通知

為了進(jìn)一步促進(jìn)我國藥用植物研究的深入，推動中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展，中國植物學(xué)會第十三屆全國藥用植物及植物藥學(xué)術(shù)研討會暨2015年海峽兩岸中醫(yī)藥科學(xué)交流會擬于2015年7月中旬在世界文化與自然雙重遺產(chǎn)、世界生物圈保護(hù)區(qū)，國家級自然保護(hù)區(qū)武夷山舉行。本次會議由中國植物學(xué)會藥用植物及植物藥專業(yè)委員會主辦，福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院承辦，福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，三明市農(nóng)科院藥用植物研究所等單位協(xié)辦。會議主題“藥用植物與中藥現(xiàn)代化”。大會將邀請國內(nèi)相關(guān)領(lǐng)域院士和知名專家學(xué)者就國內(nèi)外藥用植物與中藥現(xiàn)代化方面研究的發(fā)展趨勢、最新進(jìn)展及熱點(diǎn)領(lǐng)域、熱點(diǎn)問題等作學(xué)術(shù)報告，同時邀請多名臺灣地區(qū)該領(lǐng)域的知名學(xué)者作大會報告，促進(jìn)海峽兩岸的交流與合作。熱誠歡迎全國藥用植物及植物藥同仁踴躍參加本次學(xué)術(shù)盛會。

詳情瀏覽《中國現(xiàn)代中藥》官方網(wǎng)站(http://www.zgxdzy.net/ch/reader/view_news.aspx?id=20150318090129001)

ChangesofChemicalConstituentsinRadixAconitiPreparatabeforeandafterHeatingBasedonHPLC/ESI-MS

LINHongying1，SUChang2，DUANTianxuan1，HUANGJianmei1，SUNYikun1，WANGYue1，JIJiaojiao1，DONGJie1，LIUYonggang1*

(1.SchoolofChineseMateriaMedica，BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100029，China；2.BeijingXKCMedi&TechDevelopeCo.，Ltd.，Beijing100048，China)

Objective：To analyze the changes of chemical constituents inRadixAconitiPreparata before and after heating.Methods：The different extract ofRadixAconitiPreparata were detected by using HPLC/ESI-MS.Results：The constituents with significant differences before and after heating were identified.The results showed that a total of 13 chemical constituents were identified and nine constituents were significantly different before and after heating.Conclusion：The HPLC/ESI-MS method is proved to have a high sensitivity and the result is accurate and reliable.The method could reflect the changes of multiple chemical constituents of Chinese materia medica in the course of processing.

RadixAconitiPreparata；HPLC/ESI-MS；chemical constituents

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.3.005

2014-10-01)

北京中醫(yī)藥大學(xué)自主選題項(xiàng)目(2013-JYBZZ-JS-039)

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劉永剛，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究；Email：liuyg0228@163.com