石偉，黃道省，徐芳芳，李銳華，韓蕾，高金，孫科，張攀，蕭偉*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001；4.西北大學(xué)，陜西 西安 710069)

·中藥工業(yè)·

HPLC-ELSD測(cè)定六味地黃膠囊中熊果酸和齊墩果酸的含量

石偉1,3，黃道省2,3，徐芳芳2,3，李銳華1,3，韓蕾2,3，高金2,3，孫科3,4，張攀2,3，蕭偉2,3*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210000；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001；3.中藥制藥過程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222001；4.西北大學(xué)，陜西 西安 710069)

目的：用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)同時(shí)測(cè)定六味地黃膠囊中熊果酸和齊墩果酸的含量。方法：采用Agilent TC-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.5%醋酸的水溶液(84∶16)；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL·min-1；ELSD檢測(cè)器的漂移管溫度為40 ℃，氮?dú)鉃檩d氣，載氣流量為2.0 L·min-1。結(jié)果：熊果酸在0.176～1.584 mg·mL-1與峰面積積分值成良好的對(duì)數(shù)線性關(guān)系，r=0.999 1，平均加樣回收率為101%，RSD值為1.4%(n=6)；齊墩果酸在0.079～0.709 mg·mL-1與峰面積積分值成良好的對(duì)數(shù)線性關(guān)系，r=0.999 6，平均加樣回收率為98.1%，RSD值為1.2%(n=6)。結(jié)論：本法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，可用于同時(shí)測(cè)定六味地黃膠囊中熊果酸和齊墩果酸的含量。

六味地黃膠囊；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；熊果酸；齊墩果酸

六味地黃方為我國(guó)傳統(tǒng)古方，由熟地黃、山茱萸(制)、山藥、茯苓、丹皮和澤瀉按質(zhì)量比8∶4∶4∶3∶3∶3組成。最早記載于宋代錢乙《小兒藥證直訣、卷下諸方》[1]。六味地黃丸具有滋陰補(bǔ)腎的效用，臨床用于治療頭暈耳鳴，腎陰虧損等癥[2]。其作為一種新型的六味地黃制劑，采用現(xiàn)代工藝制作，服用方便，較易吸收?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2010版中，六味地黃膠囊含量測(cè)定指標(biāo)為熊果酸，采用雙波長(zhǎng)薄層掃描法測(cè)定其含量，但該法樣品處理繁瑣，重復(fù)性不好。本試驗(yàn)采用HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定六味地黃膠囊中熊果酸、齊墩果酸的含量，旨在探索可同時(shí)測(cè)定六味地黃膠囊中熊果酸和齊墩果酸含量的高效、準(zhǔn)確、重復(fù)性好的定量分析方法。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀(3000，Ultimate)；SEDEX 80型LT-ELSD檢測(cè)器(法國(guó)SEDERE公司)；KQ-500B超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；XP6，BP211D型電子天平(美國(guó)METTLER TOLEDO公司)。

齊墩果酸對(duì)照品、熊果酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110709-201206，110742-2005197，含量測(cè)定用)；甲醇(美國(guó)Tedia公司，色譜純)；自制純化水；其余試劑均為分析純。

六味地黃膠囊三批(0.30 g/粒，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為20130901，20131201，20140201)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent TC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為甲醇-0.5%醋酸水溶液(84∶16)；體積流量為1.0 mL·min-1；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器以氮?dú)鉃檩d氣，漂移管溫度為40 ℃，體積流量為2.0 L·min-1，增益值7。色譜圖見圖1。

注：1.齊墩果酸；2.熊果酸；A.混合對(duì)照品；B.供試品；C.酒萸肉陰性。圖1 六味地黃膠囊樣品及對(duì)照品色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品適量，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每mL含熊果酸0.936 mg、齊墩果酸0.208 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取六味地黃膠囊內(nèi)容物，研細(xì)，取粉末約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(250 W，40 kHz)30 min，放冷。再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 專屬性試驗(yàn)

按六味地黃膠囊處方比例，制備酒萸肉陰性對(duì)照藥，按2.3項(xiàng)下方法操作，制備酒萸肉陰性供試品溶液。進(jìn)樣10 μL測(cè)定，結(jié)果陰性供試品溶液色譜中在與熊果酸、齊墩果酸對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾。

2.5 線性關(guān)系考察

取熊果酸、齊墩果酸對(duì)照品適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇制成混合對(duì)照品濃溶液(熊果酸質(zhì)量濃度為1.764 mg·mL-1，齊墩果酸質(zhì)量濃度為 0.788 mg·mL-1)。精密量取1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取上述溶液各10 μL，注入，HPLC儀，測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，熊果酸：Y=1.382 2+0.332 8，r=0.999 1；齊墩果酸：Y=1.604X+0.608 3，r=0.999 6。結(jié)果表明，熊果酸和齊墩果酸分別在 0.176～1.584 mg·mL-1和 0.079～0.709 mg·mL-1與各自峰面積積分值成良好的對(duì)數(shù)線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣，連續(xù)測(cè)定6次。以熊果酸、齊墩果酸峰面積計(jì)算，RSD分別為0.82%、1.4%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取六味地黃膠囊(批號(hào)：20140201)，按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液。分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以熊果酸、齊墩果酸峰面積計(jì)算，RSD分別為1.0%和0.74%，表明供試品溶液放置12 h穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取六味地黃膠囊(批號(hào)：20140201)，按2.3項(xiàng)下的方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，六味地黃膠囊中熊果酸、齊墩果酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.50 mg·g-1和1.63 mg·g-1，RSD分別為0.93% 和1.3%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收試驗(yàn)

取已知含量的六味地黃膠囊(批號(hào)：20140201)粉末約0.25 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，分別加入882 μg·mL-1的熊果酸和394 μg·mL-1的齊墩果酸對(duì)照品溶液1 mL，揮干溶劑。按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，熊果酸的平均回收率為101%，RSD為1.%；齊墩果酸的平均回收率為98.1%，RSD為1.2%，表明樣品測(cè)定準(zhǔn)確度良好。見表1～2。

表1 熊果酸的加樣回收結(jié)果

表2 齊墩果酸的加樣回收結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定

取3批次六味地黃膠囊，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣量10 μL。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積的常用對(duì)數(shù)值按外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算六味地黃膠囊中熊果酸和齊墩果酸的含量，結(jié)果見表3。

表3 六味地黃膠囊含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

HPLC對(duì)熊果酸和齊墩果酸分離測(cè)定常用的流動(dòng)相：甲醇-0.5%醋酸銨水溶液(90∶10)[3]；乙腈-0.1%磷酸水溶液(75∶25)[4]；乙腈-水-磷酸(90∶10∶0.1)[5]。參照上述流動(dòng)相條件，結(jié)合操作簡(jiǎn)便的原則，本試驗(yàn)比較了甲醇-甲酸水溶液，乙腈-醋酸水溶液，甲醇-醋酸水溶液3種流動(dòng)相體系。結(jié)果表明，甲醇-醋酸水溶液分離效果較佳。

3.2 供試品的制備

《中華人民共和國(guó)藥典》2010版采用乙醚提取六味地黃膠囊中的熊果酸，再加無水乙醇-三氯甲烷溶解樣品。該方法操作復(fù)雜，樣品中含有三氯甲烷，可能會(huì)破壞色譜柱[6]。本試驗(yàn)考察了甲醇、乙醇兩種溶劑超聲與加熱回流提取的效果。結(jié)果表明，甲醇提取結(jié)果優(yōu)于乙醇，超聲提取優(yōu)于加熱回流提取。同時(shí)，試驗(yàn)中采用單因素對(duì)提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溶劑用量進(jìn)行優(yōu)選，最終確定本試驗(yàn)所采用的供試品溶液制備方法。

3.3 ELSD參數(shù)優(yōu)選

在載氣流速不變的條件下，對(duì)不同漂移管溫度進(jìn)行比較，確定最佳溫度為40 ℃；在漂移管溫度為40 ℃ 條件下，對(duì)不同的載氣流速(1.8、2.0、2.5 L·min-1)進(jìn)行比較，確定載氣流速為2.0 L·min-1。

3.4 檢測(cè)器選擇

熊果酸和齊墩果酸均為五環(huán)三萜類化合物，且二者互為同分異構(gòu)體，在紫外區(qū)只有末端吸收，響應(yīng)值較低且存在背景干擾，采用紫外檢測(cè)器不易進(jìn)行定量分析。因此，本試驗(yàn)采用的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器為質(zhì)量型檢測(cè)器，對(duì)三萜類成分有很好的專屬性[7]。

本試驗(yàn)建立了一種同時(shí)測(cè)定六味地黃膠囊中熊果酸和齊墩果酸含量的方法，操作簡(jiǎn)便，穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，可以作為六味地黃膠囊質(zhì)量控制方法之一。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 李全斌.六味地黃方研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，15(1)：217-219.

[3] 李濤，郝武常，徐長(zhǎng)根，等.HPLC-ELSD法測(cè)定不同產(chǎn)地女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量[J].中藥材，2005，28(5)：391-393.

[4] 麻秀萍，蔣朝暉，丁寧，等.HPLC測(cè)定馬鞭草中熊果酸的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2002，27(1)：28-30.

[5] 盧翠文.HPLC 法測(cè)定六味地黃丸熊果酸的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(4)：2070-2071.

[6] 謝寶剛，鐘琳，朱思琪，等.HPLC-UV法同時(shí)測(cè)定六味地黃制劑中丹皮酚與熊果酸[J].中成藥，2013，35(5)：970-973.

[7] 昝俊峰，徐斌，劉軍鋒，等.茯苓三萜成分RP-HPLC-ELSD指紋圖譜研究[J].中草藥，2012，43(5)：895-900.

HPLC-ELSD Method for Determination Liuwei Dihuang Capsules Ursolic Acid and Oleanolic Acid

SHI Wei1,3，HUANG Daosheng2,3，XU Fangfang2,3，LI Ruihua1,3，HAN Lei2,3，GAO Jin2,3，SUN Ke3,4，ZHANG Pan2,3，XIAO Wei2,3*

(1.Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210000，China；2.Jangsu Kanion Pharmaceutical Co.，Ltd.，Lianyungang 222001，China；3.State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process，Lianyungang 222001，China；4.North West University，Northwest University，Xi’an，Shaanxi 710069，China)

Objective：An analytical method was developed for determining the content of ursolic acid and oleanolic in different batches of Liuwei Dihuang capsules by HPLC-ELSD.Methods：Agilent TC-C18 column(250 mm×4.6 mm，5 μm)column was applied，the mobile phase was methnol-0.5% aqueous solution of acetic acid(84∶16)with gradient mode at the flow rate of 1.0 L·min-1，the column temperature was 30 ℃，the temperature of drift tube was 40 ℃ with nitrogen as carrier gas with the flow rate of 2.0 L·min-1.Results：The linear range of rrsolic acid was 0.176-1.584 mg·mL-1，showed a good linear relationship，r=0.999 1，the average recovery was 101%，RSD=1.4(n=6).The linear range of oleanolic acid was 0.079-0.709 mg·mL-1，showed a good linear relationship，r=0.999 6，the average recovery was 98.1%，RSD=1.2%(n=6).Conclusion：The method is accurate，simple，reproducible，it is suitable for determination the content of ursolic acid and oleanolic in Liuwei Dihuang capsules.

Liuwei Dihuang capsules；HPLC-ELSD；ursolic acid；oleanolic acid

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.8.022

2014-10-13)

*

蕭偉，博士生導(dǎo)師，研究員，研究方向：中藥新劑型的研究與開發(fā)；Tel：(0518)81152337， E-mail：wzhzh-nj@163.net