郝剛，王亞瓊，俞蘊(yùn)莉，朱佳慧

(1.蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州 215104；2.蘇州大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州 215004；3.蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州 215123)

·基礎(chǔ)研究·

UPLC-MS/MS法測(cè)定苦楝皮、川楝子及其制品中川楝素含量

郝剛1*，王亞瓊1，俞蘊(yùn)莉2，朱佳慧3

(1.蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 蘇州215104；2.蘇州大學(xué) 附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州215004；3.蘇州大學(xué)，江蘇 蘇州215123)

目的：基于UPLC-MS/MS方法建立苦楝皮、川楝子、炒川楝子中川楝素的定性鑒別及含量測(cè)定方法。方法：供試樣品經(jīng)甲醇加熱回流后，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，以BEH-C18為分析柱，流動(dòng)相為0.1%甲酸水-乙腈(60∶40)，電噴霧電離(ESI-)，采用一級(jí)、二級(jí)掃描及多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，對(duì)川楝子、炒川楝子、苦楝皮中川楝素進(jìn)行快速定性定量檢測(cè)。結(jié)果：所建方法能快速定性、定量檢測(cè)川楝素，定性離子對(duì)為m/z573→531和m/z573→425，川楝素在50～1000ng·mL-1線性良好，平均加樣回收率為97.6%，方法檢出限為60μg·g-1。結(jié)論：所建方法快速、靈敏，適用于川楝子、炒川楝子、苦楝皮中川楝素的快速定性鑒別及含量測(cè)定。

川楝素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；定性定量分析

川楝素(Isotoosendanin)是從楝屬植物的根莖及川楝果實(shí)中提取的一種三萜化合物，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為川楝素具有殺蟲、驅(qū)蛔等作用，近年來研究表明，川楝素還具有抑制離子通道、抑制呼吸中樞、抗腫瘤等多種生物活性[1-3]。由于川楝素具有生物毒性，《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)對(duì)川楝素的含量做了嚴(yán)格規(guī)定：川楝子中含川楝素為0.06%～0.20%；炒川楝子中含川楝素為0.04%～0.20%；苦楝皮中含川楝素為0.01%～0.20%[4]。目前文獻(xiàn)報(bào)道多采用HPLC-UV法、LC-MS法對(duì)川楝素進(jìn)行含量測(cè)定，但這些方法分析時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低、且不能提供定性依據(jù)[5-7]，本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS法對(duì)川楝子、炒川楝子、苦楝皮中川楝素進(jìn)行快速定性、定量分析。

圖1 川楝素(Isotoosendanin)化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料

1.1儀器

ACQUITYUPLCXevoTQ-S三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司)；電噴霧離子源(ESI)，Masslynx4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Waters)；Thermo低溫離心機(jī)；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器；MILLIPORE純水儀。

1.2樣品與試劑

川楝素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111842-201102，純度：94.5%)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為色譜純。

川楝子(批號(hào)：14081502)、炒川楝子(批號(hào)：13050201)、苦楝皮(批號(hào)：12121604)購(gòu)于吳江上海蔡同德堂中藥飲片有限公司，并由蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所吳銀生(主任中藥師)鑒定均為楝科植物川楝MeliatoosendanSieb.et Zucc的干燥成熟果實(shí)。由蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所王亞瓊主管中藥師按 《中華人民共和國(guó)藥典》(2010版)鑒別項(xiàng)對(duì)上述3種中藥予以鑒定[4]，結(jié)果均符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1UPLC色譜條件

色譜柱：BEH-C18色譜柱(2.1mm×50mm，1.7μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液-乙腈(60∶40)；柱溫：30℃；進(jìn)樣器溫度：15℃；流速：0.3mL·min-1；進(jìn)樣量：1μL。

2.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；負(fù)離子掃描；毛細(xì)管電壓3.0kV；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣體流量：600L·h-1；錐孔氣流量：150L·h-1；碰撞氣體為氬氣；采用一級(jí)掃描、二級(jí)掃描及多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)監(jiān)測(cè)。

2.3對(duì)照品儲(chǔ)備液制備

精密稱取川楝素對(duì)照品10mg，置10mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(1mg·mL-1)。

2.4樣品溶液制備

取樣品粉末0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1h，冷卻，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，取1mL樣品溶液，用甲醇稀釋100倍，再取1mL溶液，12000r·min-1離心5min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.5質(zhì)譜方法

將川楝素對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成100ng·mL-1的對(duì)照品溶液，采用ESI-離子化模式，直接進(jìn)樣法優(yōu)化質(zhì)譜條件。川楝素分子量為574，本實(shí)驗(yàn)采用一級(jí)質(zhì)譜掃描測(cè)得川楝素準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-為m/z573(見圖2)。DaughterScan掃描模式測(cè)得川楝素的主要二級(jí)碎片離子為m/z531和425(見圖3)，采用這兩個(gè)特征碎片離子作為川楝素定性依據(jù)，并建立多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)定量方法，川楝素對(duì)照品溶液TIC圖如圖4所示，由于川楝素存在互變異構(gòu)體異川楝素，故TIC圖出現(xiàn)雙峰[8-9]，保留時(shí)間分別為1.01min和1.16min。

圖2 川楝素對(duì)照品溶液一級(jí)掃描圖

圖3 川楝素對(duì)照品溶液二級(jí)掃描圖

圖4 川楝素對(duì)照品溶液TIC圖

2.6線性范圍

對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為1000、500、250、100、50ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液，取1μL進(jìn)樣分析，以TIC圖兩峰面積總和為縱坐標(biāo)(Y)，各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為：Y=464.6X+142.8，r=0.9995，川楝素質(zhì)量濃度在50～1000ng·mL-1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.7檢出限與定量限

儀器檢出限與定量限：用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為3ng·mL-1和10ng·mL-1的川楝素對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，3ng·mL-1的川楝素對(duì)照品溶液TIC圖以小峰計(jì)，信噪比為7.67，該濃度作為儀器檢出限(S/N>3)(見圖5A)。10ng·mL-1的川楝素對(duì)照品溶液TIC圖以小峰計(jì)，信噪比為17.84，該濃度作為儀器定量限(S/N>10)(見圖5B)。

注：A.檢出限；B.定量限。圖5 川楝素檢出限和定量限結(jié)果

方法檢出限與定量限：根據(jù)樣品溶液制備方法，樣品實(shí)際稀釋倍數(shù)為5000，計(jì)算該方法下川楝素檢出限為60μg·g-1，方法定量限為200μg·g-1。

2.8精密度試驗(yàn)

取100ng·mL-1的川楝素對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣6次，記錄TIC圖峰面積，結(jié)果川楝素兩峰面積之和RSD=1.5%(n=6)，表明精密度良好。

2.9穩(wěn)定性試驗(yàn)

取0.25g川楝子樣品，按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，按2.1和2.2測(cè)定，分別于0、1、2、4、8、12、24h測(cè)定峰面積。結(jié)果川楝素兩峰面積之和的RSD=2.07%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的川楝子供試品0.125g，精密稱定，分別精密加入一定量的川楝素對(duì)照品溶液，按樣品溶液制備方法進(jìn)行樣品前處理，按2.1和2.2條件測(cè)定回收率，結(jié)果見表1。

表1 川楝素回收率試驗(yàn)

2.11樣品測(cè)定

取川楝子、炒川楝子、苦楝皮各5份，按樣品溶液制備方法進(jìn)行樣品前處理，按2.1和2.2條件測(cè)定，3種中藥質(zhì)譜圖均出現(xiàn)m/z573→531和m/z573→425兩個(gè)特征離子對(duì)，證實(shí)3種中藥均含有川楝素。以川楝素兩個(gè)峰面積之和定量，代入線性回歸方程，計(jì)算各藥中川楝素含量，結(jié)果川楝子供試品中川楝素含量為0.16%；炒川楝子供試品中川楝素含量為0.17%，苦楝皮供試品中川楝素含量為0.17%，均符合《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)的含量規(guī)定[4]。

3 討論

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以其高效、快速、靈敏的特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于各類檢測(cè)領(lǐng)域，尤其針對(duì)中藥來源廣泛、成分復(fù)雜、分離困難等特點(diǎn)更具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，并越來越多地應(yīng)用于中藥成分分析與質(zhì)量控制[10]。《中華人民共和國(guó)藥典》(2010年版)采用HPLC-MS法對(duì)川楝子、苦楝皮等藥材中的川楝素進(jìn)行含量測(cè)定，并基于川楝素的生物毒性，對(duì)這類中藥中川楝素的含量做了嚴(yán)格規(guī)定?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》方法采用普通HPLC和單四級(jí)桿檢測(cè)器進(jìn)行定量，該方法分析時(shí)間長(zhǎng)，靈敏度低，且無(wú)法提供川楝素的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，不能用于川楝素的定性鑒別[4]。本實(shí)驗(yàn)基于UPLC-MS/MS法，通過一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜掃描確立了川楝素的兩個(gè)特征離子對(duì)：m/z573→531和m/z573→425，其中m/z531是川楝素在負(fù)離子條件下通過丟失乙?；鶊F(tuán)形成的碎片離子[M-CH3CO]-，而m/z425可能是川楝素丟失CH3CO、H2O、CO等多個(gè)基團(tuán)后形成的碎片離子[M-2CH3CO-CO-2H2O]-。將上述兩個(gè)離子對(duì)用于中藥中川楝素的定性鑒別，并進(jìn)一步通過MRM模式，建立了川楝素的定量檢測(cè)方法，方法學(xué)驗(yàn)證表明，所建方法專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析時(shí)間短，用于川楝子、苦楝皮、炒川楝子中川楝素的定性鑒別及含量測(cè)定，方法快速、準(zhǔn)確。本研究為川楝子、苦楝皮等中藥中川楝素的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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DeterminationofToosendaninwithUPLC-MS/MS

HAOGang1*，WANGYaqiong1，YUYunli2，ZHUJiahui

(1.SuzhouInstituteforFoodandDrugControl，Suzhou215104，China；2.TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity，Suzhou215004，China；3.SoochowUniversity，Suzhou215123，China)

Objective：To develop a specific，sensitive and rapid UPLC-MS/MS method for qualitative and quantitative analysis of toosendanin.Methods：Samples were heated with methanol under reflux and further detected by the ultra performance liquid chromatography-electrospray ion(ESI-)trap mass spectrometry method. The separation was performed on Waters UPLC using BEH-C18column with a isocratic elution(0.1% acetic acid∶methanol=60∶40).The qualitative and quantitative analysis of toosendanin was conducted in the MS scan，Daughter scan and MRM mode by UPLC-MS/MS.Results：Them/z573→531m/z573→425were two qualitative ion pairs of toosendanin. The calibration curves showed good linear relationship in the range of50～1000ng·mL-1for the component.The determination limits was60μg·g-1，and the average recovery rate was97.6%.Conclusion：The method was proved to be specific，rapid and sensitive，which can be used to qualitative and quantitative analysis of toosendanin

Toosendanin；UPLC-MS/MS；qualitative and quantitative

*

郝剛，主管藥師，博士，研究方向：食品藥品質(zhì)量與安全監(jiān)控；Tel：(0512)67079940，E-mail：haogang531@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.012

2015-03-19)