王瑩，劉樂天，楊柳，王海燕

(1.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長春 130000；2.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 護理部，吉林 長春 130000)

·基礎(chǔ)研究·

血竭素高氯酸鹽通過線粒體途徑誘導(dǎo)人乳腺癌細胞MCF-7凋亡

王瑩1，劉樂天1，楊柳1，王海燕2*

(1.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長春130000；2.吉林大學(xué) 第一醫(yī)院 護理部，吉林 長春130000)

目的：研究血竭素高氯酸鹽(Dracorhodin Perchlorate，DP)抗乳腺癌作用及作用機制。方法：四甲基噻唑藍法分析60μmol·L-1DP作用不同時間后，其對腫瘤細胞的抑制率；細胞形態(tài)學(xué)分析、細胞核形態(tài)學(xué)分析和DNA片段化分析確定細胞凋亡的發(fā)生；Rhodamine123染色分析細胞線粒體膜電位；Western檢測細胞凋亡相關(guān)特別是線粒體相關(guān)蛋白表達。結(jié)果：60μmol·L-1DP時間依賴性地抑制人乳腺癌MCF-7細胞生長；DP抑制細胞生長通過誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡來實現(xiàn)；DP誘導(dǎo)細胞凋亡時，其活化了線粒體通路蛋白caspase-9，剪切了DNA損傷修復(fù)蛋白PARP；進一步研究發(fā)現(xiàn)DP誘導(dǎo)細胞凋亡的主要原因是其降低了細胞線粒體膜電位(正常膜電位細胞百分比93.11%；DP處理后正常膜電位細胞百分比37.45%)；而線粒體上Bcl-2、Bcl-XL表達減少，Bax、Bak增多是DP改變線粒體膜電位的主要原因。結(jié)論：DP通過調(diào)節(jié)線粒體通路來促進細胞凋亡。

血竭素高氯酸鹽；凋亡；線粒體蛋白

血竭為棕櫚科植物麒麟竭DaemonoropsdracoB1.果實滲出的樹脂經(jīng)加工制成。此外，龍舌蘭科植物龍血樹的樹脂也作為血竭用。血竭主要成分為血竭素和血竭紅素[1]。血竭素高氯酸鹽(Dracorhodin perchlorate，DP)為人工合成品[2]，其具有抗宮頸癌作用[3]。人乳腺癌和宮頸癌為婦科主要癌癥，本研究探討血竭素高氯酸鹽抗人乳腺腫瘤作用及其機制，為進一步開發(fā)血竭素高氯酸鹽為抗婦科腫瘤藥物提供參考。

1 材料

1.1主要試藥

血竭素高氯酸鹽(中國食品藥品檢定研究院)；應(yīng)用時用二甲基亞砜(DMSO)溶解，并使DMSO的終濃度低于0.1%。DMSO、細胞核染料Hoechst3258、線粒體染料Rhodamine123(Sigma公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)，胎牛血清(北京元亨圣馬生物試劑公司)。PARP、Caspase-9、Histone、Bcl-2、Bcl-XL、Bax、Bak抗體及二抗(SantaCruz公司，CA，USA)。

1.2細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞(MCF-7)(美國AmericanTypeCultureCollection，ATCC)。細胞單層接種在含10%胎牛血清、20g·L-1谷氨酰胺的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 方法

2.1MTT分析抑制率

取對數(shù)生長期的MCF-7細胞接種于96孔培養(yǎng)板中(細胞數(shù)為每孔1×104個)，每孔100μL培養(yǎng)12h后再加入60μmol·L-1DP，每個時間點設(shè)平行孔3個，于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36、48h，每孔加入5g·L-1MTT20μL，繼續(xù)培養(yǎng)3h后，加入150μL DMSO溶解，于酶標(biāo)儀492nm處檢測，計算藥物對MCF-7細胞的離體生長抑制率。

2.2細胞形態(tài)學(xué)觀察

細胞以每孔1×105個接種于6孔板中，培養(yǎng)12h后，加入60μmol·L-1DP于24h用光學(xué)顯微鏡觀察、拍照。

2.3細胞核形態(tài)學(xué)分析

全區(qū)設(shè)立有自治區(qū)級、市級、縣級、鄉(xiāng)鎮(zhèn)四級社會保險征收服務(wù)機構(gòu)，而稅務(wù)部門根據(jù)稅源變化的特點，已收縮鄉(xiāng)鎮(zhèn)征收機構(gòu)，大多集中到縣級，對城鄉(xiāng)居民養(yǎng)老保險和醫(yī)療保險，尤其鄉(xiāng)鎮(zhèn)居民保險的征收管理帶來一定程度的不便。

細胞以每孔1×105個接種于6孔板中，培養(yǎng)12h后，加入60μmol·L-1DP于培養(yǎng)的24h加入4%多聚甲醛固定15min，棄固定液，用PBS洗1次，加入終濃度200μmol·L-1Hoechst33258染色30min，熒光顯微鏡觀察、拍照。

2.4DNA片段化分析

收集細胞，提取DNA，用2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色后紫外燈下觀察[3]。

2.5Rhodamine染色分析線粒體膜電位

按每孔5×105個細胞將MCF-7細胞接種于6孔板中，24h后加入60μmol·L-1DP作用24h，然后加入5mg·L-1Rhodamine123在37℃孵育30min。孵育過后，細胞用PBS洗兩次。熒光顯微鏡下觀察Rhodamine123染色的強度。

2.6Western blot 分析蛋白表達

收集5×106個以上細胞，1000×g 離心10min，PBS洗兩次，加入80μL 細胞裂解液(50mmol·L-1HEPES，1% Triton-100，100mmol·L-1NaF，1mmol·L-1EDTA，1mmol·L-1EGTA，2mmol·L-1正釩酸鈉，1mmol·L-1PMSF，10g·L-1Pepstatin A)于冰上裂解1h，25000×g離心5min，收集上清液。加入20μL5×上樣緩沖液[250mmol·L-1Tris-HCl(pH6.8)，100g·L-1SDS，50%甘油，5g·L-1溴酚蘭，5%二巰基乙醇]，沸水中煮3min，使蛋白變性。每個點樣孔加樣15μL樣品液，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)。凝膠上的蛋白帶轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉液封閉膜上的蛋白結(jié)合位點2h。加入一抗及堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，顯色。

細胞線粒體的裂解：收集的細胞餅加入100μL 裂解液，裂解液包括sucrose250mmol·L-1，Hepes20mmol·L-1，KCl10mmol·L-1，MgCl21.5mmol·L-1，EDTA1mmol·L-1，EGTA1mmol·L-1，dithiothreitol(DTT)1mmol·L-1，PMSF1mmol·L-1(pH7.5)，aprotinin1mg·L-1，leupeptin1mg·L-1。然后在4℃冰上裂解1h。12000×g離心30min，離心的沉淀加入30μL 裂解液[Hepes50mmol·L-1(pH7.4)，1% Triton-X100，NaF100mmol·L-1，EDTA1mmol·L-1，EGTA1mmol·L-1Sodium orthovanadate PMSF1mmol·L-1，leupeptin10mg·L-1，aprotinin10mg·L-1，pepstatin A10mg·L-1]。在冰上裂解1h。12000×g離心30min，裂解液中包含線粒體蛋白。

3 結(jié)果

3.1DP的抗腫瘤作用

DP作用12、24、36、48h后，其抑制率為(25.4±1.67)%、(38.58±1.71)%、(47.12±1.10)%、(59.89±1.47)%(見圖1)。我們采用60μmol·L-1作為實驗濃度。

3.2DP對凋亡的影響

細胞凋亡時，會發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)學(xué)變化，例如細胞浮起變圓，凋亡小體出現(xiàn)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，細胞數(shù)目減少，細胞浮起變圓，出現(xiàn)凋亡小體，而對照組細胞貼壁良好，沒有細胞死亡(見圖2A)。同樣，細胞凋亡時細胞核皺縮，熒光染料Hoechst33258染色增強。我們發(fā)現(xiàn)對照組細胞核大小均勻，顏色一致，而60μmol·L-1DP處理24h后，細胞核皺縮變亮(見圖2A)。DNA 片段化(DNA ladder)是凋亡的標(biāo)志，我們發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，出現(xiàn)DNA片段化(見圖2B)。PARP蛋白[5]是DNA損傷修復(fù)蛋白，我們發(fā)現(xiàn)DP處理后，PARP表達降低，說明DP降低DNA修復(fù)能力(見圖2C)。以上結(jié)果說明DP誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡。

注：A.DP化學(xué)結(jié)構(gòu)；B.MTT分析DP處理不同時間點的腫瘤抑制率。圖1 血竭素高氯酸鹽(DP)對乳腺癌MCF-7的抑制作用

注：A.A1、A2圖片分析DP處理24 h后細胞形態(tài)學(xué)變化，箭頭指示細胞的凋亡小體。A3、A4圖片分析DP處理24 h后細胞核形態(tài)變化，箭頭指示皺縮的細胞核。B.DP處理24 h后，DNA片段化情況，箭頭指示片段化的DNA。C.Western分析PARP蛋白表達，Histone為細胞內(nèi)參。圖2 DP對乳腺癌MCF-7凋亡的影響

3.3DP與線粒體途徑的相關(guān)性

60μmol·L-1DP處理24h后，具有正常膜電位的細胞百分比為37.45%，而對照組具有正常線粒體膜電位的細胞百分比為93.11%，也就是說55.66%的細胞在DP處理后線粒體膜電位降低(見圖3A)。Caspase-9是線粒體通路蛋白，線粒體途徑被激活后，其由Pro-caspase-9轉(zhuǎn)化為caspase-9后被活化，進而參與細胞凋亡。我們發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，活化的caspase-9表達增加(見圖3B)，說明DP降低線粒體膜電位后，激活caspase-9來介導(dǎo)凋亡。

注：A：DP處理24 h線粒體膜電位情況，***P<0.001。B：DP處理24 h后，Western分析caspase-9蛋白表達，Histone為細胞內(nèi)參。圖3 DP對線粒體途徑的影響

3.4線粒體相關(guān)蛋白的分布

線粒體膜電位降低的主要原因是線粒體相關(guān)蛋白表達和分布改變。我們提取總的線粒體相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)60μmol·L-1DP處理24h后，具有降低膜電位功能的Bax蛋白表達增加，而具有穩(wěn)定膜電位功能的Bcl-2蛋白表達降低，但DP對Bak、Bcl-XL蛋白表達沒有明顯的影響(見圖4A)。繼而我們分離了細胞內(nèi)的線粒體，觀察蛋白在線粒體的分布。研究發(fā)現(xiàn)具有降低膜電位功能的Bax、Bak表達增加，而具有穩(wěn)定膜電位功能的Bcl-2、Bcl-XL表達降低。所以DP有改變線粒體相關(guān)蛋白表達和定位的能力。

注：A.DP處理24 h后細胞線粒體蛋白的表達情況，Histone為細胞內(nèi)參；B.DP處理24 h后，提取分析線粒體蛋白，Western分析蛋白表達。圖4 DP對線粒體蛋白表達和定位的影響

4 討論

近年來，從中草藥中尋找安全有效的腫瘤化療替代藥物成為研究的熱點之一。乳腺癌發(fā)病率自20世紀(jì)70年代末開始一直呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。已知血竭素高氯酸鹽(DP)對人宮頸癌具有抗腫瘤效果[3]，本課題研究DP的抗婦科癌癥乳腺癌效果。研究發(fā)現(xiàn)DP可以有效的抑制乳腺癌細胞MCF-7細胞生長，并通過凋亡方式促進細胞的死亡。說明DP可以成為潛在的抗乳腺癌藥物。

線粒體途徑是細胞凋亡通路之一。當(dāng)線粒體膜電位降低的時候，細胞內(nèi)的AIF和cytochrome C 會從線粒體內(nèi)釋放出來，促進pro-caspase-9剪切活化為caspase-9，進而促進caspase-3的活化。我們研究發(fā)現(xiàn)DP降低線粒體膜電位，并促進caspase-9的活化，說明DP攻擊細胞的線粒體來促進細胞凋亡。MCF-7細胞是caspase-3缺失的細胞[7]，所以caspase-9的作用無法傳遞給下游的caspase-3，但我們同樣觀察到了PARP表達降低、細胞核皺縮、DNA片段化、凋亡小體出現(xiàn)等凋亡現(xiàn)象，說明DP對caspase-3缺失的細胞仍具有促進其凋亡的作用，而DP可能活化caspase-3以外的凋亡因子，這需要進一步的實驗研究。

線粒體膜電位降低的主要原因是線粒體相關(guān)蛋白表達以及分布改變。Bax和Bak等線粒體蛋白以同源二聚體形式存在時，會在線粒體上打孔來降低線粒體膜電位。而Bcl-2和Bcl-XL等線粒體蛋白以同源二聚體形式存在時，會穩(wěn)定線粒體的膜電位[6]。我們研究發(fā)現(xiàn)DP處理后，Bcl-2的表達降低，而Bax表達增加，但Bak和Bcl-XL表達沒有明顯的改變，說明DP可以調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白表達。同樣我們通過提取線粒體蛋白觀察了他們在線粒體的分布，研究發(fā)現(xiàn)線粒體的Bax和Bak表達增多，而Bcl-2和Bcl-XL表達減少。這樣Bcl-2和Bcl-XL穩(wěn)定線粒體膜電位的作用被Bax和Bak抑制了。說明DP可以調(diào)節(jié)線粒體相關(guān)蛋白定位來促進細胞凋亡。

總之，DP通過改變線粒體膜電位來促進細胞凋亡，DP具有抗乳腺癌作用，是潛在的抗乳腺癌藥物。

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DracorhodinPerchlorateInducedHumanBreastCancerMCF-7CellApoptosisthroughMitochondrialPathway

WANGYing1，LIULetian1，YANGLiu1，WANGHaiyan2*

(1.DepartmentofGastroenterology，TheFirstHospitalofJilinUniversity，JilinUniversity，Changchun130000，China；2.Nursingdepartment，TheFirstHospitalofJilinUniversity，JilinUniversity，Changchun130000，China)

Objective：To investigate the anti-tumor effect and the mechanism of Dracorhodin perchlorate(DP)in human breast cancer MCF-7.Methods：The inhibitory rate of60μmol·L-1DP to tumor cell was measured by MTT analysis. Cell morphology analysis，nuclear morphology analysis，and DNA fragmentation test were applied for detecting apoptosis. Rhodamine123staining was used for mitochondrial membrane potential(MMP). Western blot was applied for protein expression.Results：60μmol·L-1DP inhibited MCF-7growth in time-dependent manner，and the inhibition of DP resulted from apoptosis. The caspase-9was activated when DP induced apoptosis，and PAR Pexpression was decreased after DP treatment. The decreased MMP led to apoptosis(in control group93.11% cells kept normal MMP，but in DP-treated group only37.45% kept normal MMP). Mitochondrial Bcl-2and Bcl-XL were decreased，and Bax and Bak were increased，which led to decreased MMP in MCF-7cells.Conclusion：DP induced apoptosis through mitochondrial pathways.

Dracorhodin perchlorate；apoptosis；mitochondrial protein

*

王海燕，主管護師，研究方向：腫瘤治療與癌癥患者護理；Tel：(0431)88783436，E-mail：422321732@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.008

2015-03-10)