景欣悅，丁永芳，黃一平，彭蘊(yùn)茹*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028)

·基礎(chǔ)研究·

藏藥郎慶阿塔對(duì)肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1、α-SMA和瘦素受體的影響△

景欣悅1，丁永芳2，3，黃一平2，3，彭蘊(yùn)茹2，3*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京210028；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京210028)

目的：研究藏藥郎慶阿塔對(duì)肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1、α-SMA和瘦素受體的影響。方法：以復(fù)合因素造成大鼠肝纖維化模型，模型大鼠經(jīng)郎慶阿塔干預(yù)后，以免疫組化法檢測肝組織中TGF-β1和α-SMA的表達(dá)水平，以熒光定量PCR(Q-PCR)法檢測肝組織瘦素受體mRNA的水平。結(jié)果：由免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)郎慶阿塔能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中TGF-β1和α-SMA的表達(dá)水平(P<0.01)，Q-PCR結(jié)果表明郎慶阿塔能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中瘦素受體mRNA的表達(dá)。結(jié)論：藏藥郎慶阿塔具有明顯減少肝纖維化大鼠肝臟TGF-β1、α-SMA和瘦素受體表達(dá)的作用。

藏藥；郎慶阿塔；肝纖維化

肝纖維化是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界急需解決的一個(gè)難題，目前臨床上尚缺乏有效的治療藥物，而民族醫(yī)藥特別是藏醫(yī)藏藥在此疾病治療領(lǐng)域顯示出了很好的療效。藏藥“郎慶阿塔”是西藏那曲縣藏醫(yī)世家名人那本朗次仁祖?zhèn)鞯慕?jīng)驗(yàn)方，此藥至今已有580多年的歷史，由牛黃、西紅花、五靈脂、余甘子、印度獐牙菜等10余味藥組成，具有清熱解毒、舒肝利膽的功效，幾百年來當(dāng)?shù)夭蒯t(yī)將其用于肝病治療效果顯著[1-5]，而近幾十年來當(dāng)?shù)夭蒯t(yī)在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝纖維化具有很好的臨床療效。本課題組前期已從實(shí)驗(yàn)的角度證實(shí)了郎慶阿塔具有顯著的抗肝纖維化作用[6-7]，而本文進(jìn)一步研究其對(duì)肝纖維化模型大鼠肝臟肝纖維化相關(guān)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和瘦素受體的影響，以期為其臨床應(yīng)用及今后的新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1動(dòng)物

Wistar大鼠，♀♂各半，清潔級(jí)，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)，飼養(yǎng)合格證號(hào)：SYXK(蘇)2007-0026。

1.2供試品

郎慶阿塔(浸膏)：含生藥2.6055g·mL-1，批號(hào)：20110608，江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥制劑研究室提供。

1.3陽性對(duì)照藥及試劑

復(fù)方鱉甲軟肝片(內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技股份有限公司，0.5g/片，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字Z19991011，批號(hào)：20110204)；四氯化碳(CCl4)分析純(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20101212)；轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)單克隆抗體(R&D Systems公司)；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)單克隆抗體(Santa Cruz公司)；抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(Dako公司)；First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司)；SYBR Green qPCRMaster Mix(2X)(promega公司)；Trizolpeagent[英濰捷基(INVITROGEN)公司]；PCR擴(kuò)增用引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。

1.4儀器

FEJ-2000B型電子天平(福州福日電子有限公司)；PB303-N型電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；HypercenterXP型組織脫水機(jī)(英國Shandon公司)；Histocentre2型包埋機(jī)，(英國Shandon公司)；MICROM-340E型切片機(jī)(德國Zeiss公司)；BX51型顯微鏡(日本Olympus公司)，StratageneMX3000P熒光定量PCR儀。

2 方法

2.1肝纖維化大鼠模型的建立及分組給藥方法

清潔級(jí)Wistar大鼠104只，體重150～180g，雌雄各半，取14只作為正常對(duì)照組(不造模)，其余90只按文獻(xiàn)方法采用復(fù)合因素制備大鼠肝纖維化模型[6-8]。造模6周末隨機(jī)處死12只造模大鼠，通過肝組織病理檢查(H-E染色及Masson染色觀察肝組織內(nèi)纖維化程度)及血清肝功能指標(biāo)來檢查肝纖維化模型成功率。將造模大鼠按ALT、AST指標(biāo)隨機(jī)分為5組，即模型對(duì)照組，陽性藥復(fù)方鱉甲軟肝片組，郎慶阿塔給藥高、中、低劑量組，另設(shè)正常對(duì)照組。各組大鼠于分組后即日(第7周)開始灌胃給藥。郎慶阿塔高、中、低劑量組灌胃給予郎慶阿塔藥液11.4、5.7、2.85g生藥·kg-1，陽性藥組則灌胃給予復(fù)方鱉甲軟肝片0.55g·kg-1，正常及模型組均灌胃給予等容積的蒸餾水，所有大鼠灌胃容積均為10mL·kg-1，每日1次，連續(xù)灌胃給藥7周。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠每周仍皮下注射1次40%CCl4/橄欖油溶液，劑量為0.3mL·(100g)-1，繼續(xù)維持造模4周。

2.2觀測指標(biāo)

2.2.1肝臟組織中TGF-β1和α-SMA的表達(dá) 取肝右葉同一部位組織標(biāo)本放入10%中性磷酸福爾馬林液中固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行α-SMA、TGF-β1免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫水，微波修復(fù)，3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗，4℃過夜，滴加二抗，37℃孵育0.5h，所有切片同時(shí)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。在全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)上，采用HPIAS-2000型圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，每組取10只大鼠，每只大鼠取一張切片，隨機(jī)選取每張切片5個(gè)視野，400倍放大，以細(xì)胞漿呈明顯黃色(棕黃色)作為陽性細(xì)胞，測定每個(gè)視野下陽性反應(yīng)的平均光密度、陽性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積，計(jì)算陽性面積率(陽性面積率=單位面積中陽性反應(yīng)的總面積/單位面積中細(xì)胞的總面積×100%)。以每例5個(gè)視野的平均光密度、陽性面積率的平均值作為該例的測量值。

2.2.2肝臟組織中瘦素受體mRNA的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR(Real-time Q-PCR)法。采用TrizoL法提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA；瘦素受體引物由Primer premier5.0software軟件自行設(shè)計(jì)，由南京生興生物公司合成。引物序列見表1。使用Stratagene MX3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。SYBR反應(yīng)體系25μL。反應(yīng)條件：95℃、10min，1個(gè)循環(huán)；95℃、15s，60℃、30s，40個(gè)循環(huán)；72℃、30s。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀自帶軟件計(jì)算獲得產(chǎn)物的 Ct值。溶解曲線如圖1所示，引物特異性較好，采用相對(duì)定量2-△△Ct法計(jì)算瘦素受體mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 內(nèi)參基因及目的基因引物序列

圖1 Q-PCR溶解曲線

2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)果

3.1肝臟組織H-E染色結(jié)果

由圖2H-E染色結(jié)果可見，正常對(duì)照組大鼠肝臟組織未見明顯病理學(xué)改變，肝細(xì)胞以中心靜脈向周圍放射狀排列，肝細(xì)胞無異型，間隙中見散在枯否細(xì)胞(見圖2A)，造模6周模型組大鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)被破壞，可見膠原纖維組織增生、穿插，將肝組織分割為大小不等的圓形或橢圓形假小葉，并見大量炎癥細(xì)胞浸潤(見圖2B)。表明模型組大鼠已形成明顯的肝纖維化病變。

注：A. 正常對(duì)照組；B. 模型組造模6周。圖2 大鼠肝組織H-E染色圖(×200)

3.2肝臟組織TGF-β1和α-SMA的免疫組化檢查結(jié)果

為了清楚顯示染色情況，通過光鏡觀察免疫組化切片(見圖3、圖4)。TGF-β1陽性細(xì)胞為棕黃色，呈胞漿表達(dá)，正常對(duì)照組僅在中央靜脈周圍有輕微表達(dá)，模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)，主要分布在中央靜脈周圍、肝包膜附近及纖維組織增多的區(qū)域，在肝竇內(nèi)間質(zhì)細(xì)胞及匯管區(qū)炎癥細(xì)胞胞漿內(nèi)，部分膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞胞漿也有表達(dá)，與增生的纖維組織分布相一致。而陽性對(duì)照組和高劑量組TGF-β1陽性細(xì)胞也僅見輕微表達(dá)(圖見3C、3D)。如表2所示，與正常組比較，模型組大鼠肝組織中TGF-β1表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組對(duì)造模大鼠肝組織中增加的TGF-β1表達(dá)水平有明顯抑制作用(P<0.01)。

鏡下可見，α-SMA在胞漿表達(dá)，正常對(duì)照組只表達(dá)于小動(dòng)脈及小靜脈，在膽管無表達(dá)。模型組α-SMA主要表達(dá)于匯管區(qū)及纖維間隔，且呈長橢圓形或梭形(見圖4)。實(shí)驗(yàn)表明模型組α-SMA免疫組織化學(xué)染色表達(dá)明顯升高，顯著高于正常組(P<0.01)。郎慶阿塔顆粒各給藥組、陽性藥鱉甲軟肝片組的α-SMA免疫組織化學(xué)染色表達(dá)與模型組比較明顯減少(P<0.01)。

表2 郎慶阿塔對(duì)肝纖維化模型大鼠肝臟組織TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響

注：與模型對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

注：A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.陽性藥組；B.高劑量組。圖3 大鼠肝組織TGF-β1免疫組化圖(×200)

注：A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.陽性藥組；B.高劑量組。圖4 大鼠肝組織α-SMA免疫組化圖(×200)

3.3瘦素受體mRNA的表達(dá)

注：與正常對(duì)照組比較，***P<0.001；與模型對(duì)照組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖5 大鼠肝組織中瘦素受體的mRNA表達(dá)

各組大鼠肝組織瘦素受體mRNA表達(dá)如圖5所示，模型組大鼠肝臟瘦素受體mRNA水平顯著升高(P<0.001)。郎慶阿塔顆粒高、中劑量給藥組、陽性藥鱉甲軟肝片組大鼠肝臟瘦素受體mRNA水平與模型組比較顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

4 討論

肝纖維化的形成是一個(gè)多因素、多細(xì)胞參與的復(fù)雜過程，其中一些細(xì)胞因子的作用日益受到人們關(guān)注。TGF-β1被認(rèn)為是目前致肝纖維化最重要的細(xì)胞因子之一，與肝纖維化的發(fā)生機(jī)制有密切關(guān)系[9-10]。TGF-β1在肝纖維化形成過程中可促進(jìn)膠原基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成與沉積，并且抑制其降解；同時(shí)，TGF-β1也是引起肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)激活并促進(jìn)其表達(dá)ECM最有力的細(xì)胞因子，在促進(jìn)HSC活化時(shí)起中心作用[11]。研究表明，肝纖維化發(fā)生過程中，多種致病因子啟動(dòng)了肝纖維化的形成，使間質(zhì)細(xì)胞、炎癥細(xì)胞等對(duì)TGF-β1合成增加，TGF-β1使HSC活化、增殖，HSC又可分泌大量TGF-β1，這種自分泌的正反饋機(jī)制使TGF-β1加強(qiáng)HSC合成膠原，從而導(dǎo)致肝纖維化的持續(xù)發(fā)展[12-14]。因此，抑制TGF-β1的表達(dá)對(duì)于肝纖維化的治療至關(guān)重要。本課題組前期已成功建立了大鼠肝纖維化模型，造模大鼠血清ALT及AST水平顯著升高，病理組織學(xué)檢查可見膠原纖維組織增生、穿插，將肝組織分割為大小不等的圓形或橢圓形小葉，并見大量炎性細(xì)胞浸潤。Masson染色示肝組織內(nèi)大量纖維組織增生，表明造模大鼠有明顯肝纖維化病變，模型適用于研究藥物的抗肝纖維化作用。從實(shí)驗(yàn)的角度證實(shí)郎慶阿塔具有顯著的抗肝纖維化作用[6-7]，肝血生化的分析結(jié)果表明，郎慶阿塔可顯著降低肝纖維化大鼠血清ALT、AST、ALP、T-BIL水平及肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)(HA、LN、PIIINP及CIV)[6]，并能明顯降低肝纖維化大鼠肝組織中異常增高的羥脯氨酸水平及I型膠原mRNA表達(dá)水平[6-7]，病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)郎慶阿塔對(duì)肝纖維化大鼠肝纖維組織增生有顯著改善作用[7]。本文研究發(fā)現(xiàn)，與模型大鼠相比，給予郎慶阿塔處理的大鼠其肝臟組織中TGF-β1的表達(dá)顯著降低。

目前研究顯示，HSC的激活與增生是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，激活后的HSC進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，合成大量細(xì)胞外基質(zhì)并沉積在肝組織，最終導(dǎo)致肝纖維化的形成。激活的HSC表達(dá)α-SMA，因此，α-SMA被認(rèn)為是HSC活化的標(biāo)志[15-16]。本研究表明，郎慶阿塔處理肝纖維化大鼠肝臟組織中α-SMA的表達(dá)明顯降低，與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

瘦素主要是由脂肪組織分泌，通過與瘦素受體結(jié)合調(diào)節(jié)中樞及外周組織重要的生理功能。正常肝組織不表達(dá)瘦素，而有瘦素受體的表達(dá)[17]，通過與肝細(xì)胞瘦素受體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)葡萄糖的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝，脂肪的分解合成及胰島素信號(hào)的調(diào)控[18]。研究表明，瘦素及瘦素受體與肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)。Sakaida等[19]采用瘦素受體缺陷大鼠模型，連續(xù)8周注射豬血清建立大鼠肝纖維化模型，發(fā)現(xiàn)瘦素受體缺陷的雄性Zucker(fa/fa)大鼠肝臟羥脯氨酸含量較雜合子大鼠(fa/-)顯著降低，Zucker(fa/fa)大鼠α-SMA的mRNA也顯著低于對(duì)照組。證明瘦素參與了肝臟纖維化的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠肝組織瘦素受體mRNA表達(dá)明顯升高，說明瘦素確實(shí)參與了肝纖維化的進(jìn)程。郎慶阿塔處理組大鼠肝組織瘦素受體mRNA表達(dá)明顯降低。

由于肝纖維化發(fā)生與發(fā)展過程極為復(fù)雜，是由多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果，因此，只針對(duì)單一環(huán)節(jié)的治療藥物難以達(dá)到滿意療效，這也是目前肝纖維化臨床治療的難點(diǎn)，而在這方面，傳統(tǒng)醫(yī)藥則展現(xiàn)了良好的治療前景。近年來，藏醫(yī)藥治療肝纖維化的作用不斷得到臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。郎慶阿塔作為治療肝病的藏藥經(jīng)驗(yàn)方，有著深厚的臨床基礎(chǔ)，但關(guān)于其作用機(jī)理仍未得到闡明。本研究證實(shí)，郎慶阿塔處理可降低肝纖維化大鼠模型肝纖維化相關(guān)因子TGF-β1、α-SMA和瘦素受體的表達(dá)，但其抗肝纖維作用機(jī)制是否直接通過抑制這些肝纖維化相關(guān)因子，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的研究和探討。

[1] 高玉萍，王寧萍.藏藥松石丸對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝纖維化的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2005，11(5)：47-48.

[2] 更登.藏藥久美70味松石丸對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠肝硬化的影響[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志，2002(54)：39-41.

[3] 馮海蓮，王寧萍.七十味松石丸對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性肝硬化的影響[J].中成藥，2005，27(6)：741-742.

[4] 卓瑪，蘭科加.藏藥十八味大象紅花散治療肝硬化36例臨床分析[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2007(3)：21，44.

[5] 德慶白珍.復(fù)方藏藥達(dá)堆治療肝硬化的臨床試驗(yàn)[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志，2004，4(2)：129-131.

[6] 彭蘊(yùn)茹，丁永芳，羅宇慧，等.藏藥郎慶阿塔治療肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(11)：189-194.

[7] 薛娟，彭蘊(yùn)茹，丁永芳，等.藏藥郎慶阿塔對(duì)肝纖維化大鼠膠原代謝的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(24)：260-265.

[8] 高愛梅，平潔，汪暉.吲哚-3-原醇對(duì)復(fù)合因素所致肝纖維化大鼠的治療作用及部分機(jī)制研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27(6)：764.

[9] Brenner DA.Molecular pathogenesis of liver fibrosis[J].Trans Am ClinClimatolAssoc，2009，120：361-368.

[10] Popov Y，Schuppan D，Popov Y，et al.Targeting liver fibrosis：strategies for development and validation of antifibrotic therapies[J].Hepatology，2009，50(4)：1294-1306.

[11] Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis[J].Gastroenterology，2008，134(6)：1655-1669.

[12] Jiao J，F(xiàn)riedman SL，Aloman C.Hepatic fibrosis[J].CurrOpinGastroenterol，2009，25(3)：223-229.

[13] Ghiassi-Nejad Z，F(xiàn)riedman SL.Advances in antifibrotic therapy[J].Expert Rev GastroenterolHepatol，2008，2(6)：803-816.

[14] Friedman SL.Hepatic fibrosis -- overview[J].Toxicology，2008，254(3)：120-129.

[15] Mallat A，Lotersztajn S.Liver fibrosis：from pathophysiology to therapeutic openings[J].GastroenterolClinBiol，2009，33(8-9)：789-798.

[16] Tsukada S，Parsons CJ，Rippe RA.Mechanisms of liver fibrosis[J].ClinChimActa，2006，364(1-2)：33-60.

[17] 甘立霞.瘦蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及瘦蛋白抵抗機(jī)制[J].生命的化學(xué)，2011，3l(5)：656-661.

[18] 劉芹，李云，甘立霞.瘦素在肝臟中的生理功能及其在肝臟疾病中的作用[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，28(6)：876-879.

[19] Sakaida I，Jinhua S，Uchida K，et al.Leptin receptor-deficient Zucker(fa/fa)rat retards the development of pig serum-induced liver fibrosiswithKupfercelldysfunction[J].Life Sci，2003，73(19)：2491-2501.

EffectofLangQingATaonTGF-β1，α-SMAandOB-RofCollageninRatHepaticFibrosisModel

JINGXinyue1，DINGYongfang2，3，HUANGYiping2，3，PENGYunru2，3*

(1.No.2ClinicalMedicalCollege，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.AffiliatedJiangsuProvincialHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；3.JiangsuProvincialAcademyofTraditionalChineseMedicine，Nanjing210028，China)

Objective：To study the effect of Lang Qing A Ta(LQAT)on TGF-β1，α-SMA and OB-R of collagen in rat hepatic fibrosis model.Methods：Composite factors were used to induce the hepatic fibrosis models in rats and the model rats were orally treated with corresponding decoctions. The levels of TGF-β1andα-SMA in livers were measured by immunohistochemisty.The mRNA expression of leptin receptor was detected with real-time Q-PCR.Results：LQAT decoction could remarkably decrease the levels of TGF-β1andα-SMA in livers of hepatic fibrosis rats.The mRNA expression of OB-R in the rat liver tissues of the LQAT treatment groups was significantly decreased as compared with that of the model group.Conclusion：The therapeutic effect of LQAT decoction on hepatic fibrosis was correlated closely with inhibiting HSC activation and mRNA expression of OB-R in the rat liver tissues.

Tibetan medicine；Lang Qing A Ta；hepatic fibrosis

江蘇省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(LZ13081)

*

彭蘊(yùn)茹，研究員，研究方向：中藥藥理；Tel：(025)52362105，E-mail：pengyunru@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.12.007

2015-10-14)