張宇晨，宋延平，王昌利，王偉

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003)

·基礎(chǔ)研究·

陜重樓甾體皂苷類單體豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)

SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響△

張宇晨1，宋延平2*，王昌利1，王偉1

(1.陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003)

目的：探討陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響。方法：將不同濃度單體A(BM-26)與人肝癌SMMC-7721細(xì)胞分別在24、48、72 h處理后，采用MTT法，測(cè)定吸光度A值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，檢測(cè)陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果：不同質(zhì)量濃度陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞均有抑制作用：24 h處理時(shí)，質(zhì)量濃度為8、40、200 μg·mL-1，1、5、25 mg·mL-1組與對(duì)照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；48 h處理時(shí)，質(zhì)量濃度為0.3、1.6、8、40、200 μg·mL-1，1 mg·mL-1組與對(duì)照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；72 h處理時(shí)，質(zhì)量濃度為8、40 μg·mL-1組與對(duì)照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。其中質(zhì)量濃度為8 μg·mL-1時(shí)，在24、48、72 h抑制率分別為45%、41%、36%。結(jié)論：陜重樓單體A(BM-26)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖具有一定的抑制作用，且最強(qiáng)抑制質(zhì)量濃度為8 μg·mL-1，有效抑制質(zhì)量濃度范圍是8～40 μg·mL-1。

陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)；人肝癌SMMC-7721細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

重樓藥用價(jià)值很高，具有清熱解毒、消腫散瘀、止血止痛之功能[1]。常作為主藥入方或單味用于腫瘤及其他病的治療。陜產(chǎn)重樓，別名七葉一枝花、燈臺(tái)七、蚤休，為百合科植物七葉一枝花ParispolyphyllaSmith Var.chinensis(Franch)Hara的干燥根莖，主產(chǎn)于秦嶺、太白山等地區(qū)。能清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚。用于治療疔瘡癰腫，咽喉腫痛，毒蛇咬傷，跌撲傷痛，驚風(fēng)抽搐。[2]前期研究已證明陜西重樓乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位對(duì)離體H180和H22腫瘤細(xì)胞株有一定的抑制作用，本文中陜重樓正丁醇提取物單體化合物A(BM-26)為豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside)，外觀為無(wú)定型白色粉末，易溶于吡啶，可溶于甲醇，ESI-MS m/z：575 [M+H]+，分子式為C35H58O6。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽(yáng)性，說(shuō)明陜重樓正丁醇提取物單體化合物A(BM-26)為甾體類成分。本文觀察了陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的影響。

1 材料

1.1 藥物與試劑

陜重樓提取物單體A(BM-26)，由陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王昌利教授提供；順鉑注射液(齊魯制藥有限公司)；噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(Sigma公司)；1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(Heclone公司)；胰蛋白酶消化液(西安舟鼎國(guó)公司)。

1.2 細(xì)胞

人肝癌SMMC-772l瘤株由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所引進(jìn)，人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用含有10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，將人肝癌SMMC-7721細(xì)胞用貼壁細(xì)胞培養(yǎng)方式培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2條件下，0.25%胰酶消化細(xì)胞，按1∶2 比例，2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器

顯微鏡、普通光學(xué)顯微鏡(日本olympus公司)；TDZ4AWS臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)；恒溫培養(yǎng)箱(Heraeus公司)；96孔培養(yǎng)板(美國(guó)Corning公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)

將SMMC-7721細(xì)胞按1×106/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為12組，分別為對(duì)照組、陽(yáng)性組、給藥10個(gè)濃度梯度組。給藥組加入不同質(zhì)量濃度的BM-26藥物，使其最終質(zhì)量濃度分別為25、5、1 mg·mL-1，200、40、8、1.6、0.3、0.064、0.013 μg·mL-1；空白對(duì)照組加入與藥物等體積的PBS緩沖液；陽(yáng)性組(順鉑)藥物最終質(zhì)量濃度為30 μg·mL-1。每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，分別培養(yǎng)24、48、72 h，棄上清液；加入質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的MTT(10 μL/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液；加入DMSO(100 μL/孔)，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm處測(cè)吸收度，記錄吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率IR，計(jì)算公式：IR=(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)×100%。以抑制率(%)為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)繪制劑量—效應(yīng)生長(zhǎng)曲線，見圖1。

2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

24 h處理時(shí)，質(zhì)量濃度為8、40、200 μg·mL-1，1、5、25 mg·mL-1組及陽(yáng)性組與對(duì)照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；48 h處理時(shí)，質(zhì)量濃度為0.3、1.6、8、40、200 μg·mL-1，1 mg·mL-1組及陽(yáng)性組與對(duì)照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；72 h處理時(shí)，質(zhì)量濃度為8、40 μg·mL-1組及陽(yáng)性組與對(duì)照組相比較，吸光度A值有顯著性降低(P<0.01或P<0.05)。其中質(zhì)量濃度為8 μg·mL-1時(shí)，在24、48、72 h吸光度最小，抑制率分別為45%、41%、36%。結(jié)果見表1、圖1。

表1 陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖的影響

注：與模型對(duì)照組比較**P<0.01，*P<0.05。

圖1 陜重樓甾體皂苷類單體A(BM-26)對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞抑制率的影響

4 討論

中藥抗腫瘤作用的研究已證實(shí)重樓醇提物有抗腫瘤、誘導(dǎo)凋亡等作用[3]。以此為參考，研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物對(duì)肝癌的治療具有重要臨床意義。

重樓化學(xué)成分為甾體皂苷、游離氨基酸、植物甾醇、植物蛻皮激素、黃酮和少量的微量元素。其中甾體皂苷為其抗腫瘤有效成分，甾體骨架的不同使其抗腫瘤活性表現(xiàn)出明顯差異。甾體皂苷約占重樓總化合物的80%，其皂苷元多為薯蕷皂苷元，次為偏諾皂苷元，并含有氨基酸、甾酮、蛻皮激素、黃酮苷等化合物，其中重樓皂苷為抗腫瘤有效成分[4]。

有研究者對(duì)滇重樓的乙酸乙酯和正丁醇萃取物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，從中分離多個(gè)化學(xué)單體，并考察了分離鑒定的單體化合物的抗腫瘤作用[5]。

近年來(lái)對(duì)滇重樓的抗腫瘤研究已經(jīng)從其藥效作用深入到細(xì)胞毒性的作用，而對(duì)陜西重樓抗腫瘤藥理研究卻極少。李秦康[6]報(bào)導(dǎo)：陜西重樓乙酸乙酯提取部位和乙醇提取部位對(duì)S180、H22有一定的抑制作用，石油醚提取部位僅對(duì)H22有一定的抑制作用。筆者前期研究表明，陜重樓乙酸乙酯提取物可使肝癌SMMC-7721細(xì)胞系中Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax值降低，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[7]。

陜重樓單體A(BM-26)為豆甾醇-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷屬甾體類皂苷。研究表明單體A質(zhì)量濃度為8 μg·mL-1時(shí)，對(duì)人體肝癌SMMC-7721細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng)，當(dāng)劑量增加或降低時(shí)，抑瘤效果均降低，有效抑制濃度范圍是8～40 μg·mL-1。其作用原理有待進(jìn)一步研究。

[1] 肖培根，楊世林.新編中藥志[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2002.704-711.

[2] 李世全，周大衛(wèi)，楊光明.秦嶺巴山天然藥物志[M].陜西：陜西科學(xué)技術(shù)出版社，1987.245-246.

[3] 季申，周壇樹，張錦哲.中藥重樓和云南白藥中抗腫瘤細(xì)胞毒活性物質(zhì)Gracillin的測(cè)定[J].中成藥，2001，23(2)：212-215.

[4] 王艷霞，李惠芬.重樓抗腫瘤作用研究[J].中草藥，2005，36(4)：628-6.

[5] 王羽，張彥軍，高文遠(yuǎn)，等.滇重樓的抗腫瘤活性成分的研究[J].中國(guó)中藥雜志，2007，32(14)：1425-1428.

[6] 李秦康，王昌利.陜西重樓抗腫瘤活性成分研究[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，34(3)：46-47.

[7] 宋延平，楊潔，王偉，等.陜重樓提取物對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞bcl-2和Bax基因表達(dá)的影響[J].陜西中醫(yī)，2013，34(4)：502-503.

Inhibiting effect of Rhizoma Parid Steroidal Saponins Monomer stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosideonProliferationofHumanhepatocarcinomaSMMC-7721Cells

ZHANG Yuchen1，SONG Yanping2*，WANG Changli1，WANG Wei1

(1.Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi xianyang 712046，China；2.Shaanxi Institute of Traditional Chinese Medicine，shaanxi Xi’an 710003，China)

Objective：To study the inhibitory effect of the Rhizoma Parid steroidal saponins monomer A(BM-26)stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranoside on the proliferation of human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells.Methods：The SMMC-7721 cells were treated with monomer A(BM-26)of different concentration in 24，48 and 72 hours respectively.MTT assay was applied to measure the inhibition ratio of proliferation，and the effect of A(BM-26)on proliferation of cancer cells was calculated.Results：A(BM-26)in different weight and concentration showed the inhibitory effect on SMMC-7721 cells.In 24 hours the absorbance A value of A(BM-26)in concentration of 8，40，200 μg·mL-1，1，5，25 mg·mL-1was remarkably lower than that of the control group，in 48 hours the absorbance A value of A(BM-26)in 0.3，1.6，8，40，200 μg·mL-1，1 mg·mL-1was remarkably lower than that of the control group，and in 72 hours the absorbance A value of A(BM-26)in 8，40 μg·mL-1was remarkably lower than that of the control group.The inhibiting effect was the highest with the concentration of 8 μg·mL-1.In 24 h，48 h，72 h inhibition rates were 45、41、36%，respectively.Conclusion：A(BM-26)has an certain inhibitory effect on SMMC-7721 cells，and the strongest inhibitory concentration is 8 μg·mL-1，and the effective inhibitory concentration ranges 8-40 μg·mL-1.

Rhizoma Parid steroidal saponins monomer A(BM-26)；hunman liver cancer SMMC-7721 cells；apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.008

2014-07-09)

陜西省中醫(yī)管理局中醫(yī)藥科研課題(NO.JC17)

*

宋延平，研究員，研究方向：腫瘤與心血管；E-mial：sypdd2003@163.com