徐建，方成武，鄧艷梅

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800;3.安徽省滁州市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 滁州 239000)

·中藥工業(yè)·

HPLC同時(shí)測(cè)定耳聾左慈丸中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚含量

徐建1,3，方成武1,2*，鄧艷梅3

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 亳州 236800;3.安徽省滁州市食品藥品檢驗(yàn)中心，安徽 滁州 239000)

目的：建立耳聾左慈丸中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚含量的液相色譜測(cè)定法。方法：采用Acclaim C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫；紫外監(jiān)測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；流速為1.0 mL·min-1。結(jié)果：馬錢苷進(jìn)樣量在0.086 72～0.867 2 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 5(n=6)，平均回收率為99.50%，RSD=0.43%；芍藥苷進(jìn)樣量在0.189 28～1.892 8 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 9(n=6)，平均回收率為99.20%，RSD=0.47%；丹皮酚進(jìn)樣量在0.171 04～1.710 4 μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 8(n=6)，平均回收率為99.27%，RSD=0.31%。結(jié)論：該方法處理簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

耳聾左慈丸；馬錢苷；芍藥苷；丹皮酚；高效液相色譜法

耳聾左慈丸由熟地黃、山茱萸、牡丹皮等8味藥物組成，具有滋腎平肝的功能，用于肝腎陰虛、耳鳴耳聾、頭暈?zāi)垦?，效果顯著[1-4]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部只有山茱萸中的馬錢苷含量測(cè)定，為了有效控制其質(zhì)量，現(xiàn)用液相色譜法同時(shí)測(cè)定其中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的含量。

1 儀器與材料

Waters e2695高效液相色譜；Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器；馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為：111640-200502，110736-201136，110708-200506)；耳聾左慈丸(上海和黃藥業(yè)有限公司，批號(hào)分別為：130407，120811，121203)；甲醇為色譜純，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Acclaim C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：235 nm；柱溫：25 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取馬錢苷對(duì)照品5.42 mg、芍藥苷對(duì)照品10.69 mg、丹皮酚對(duì)照品11.83 mg，分別置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為母液；再分別精密吸取母液5 mL置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取耳聾左慈丸，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，精密稱定重量，超聲處理60 min，放冷至室溫，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照試驗(yàn)

按處方比例分別制備缺山茱萸和牡丹皮藥材的陰性藥品，按2.3方法，得到陰性供試品溶液。取對(duì)照品溶液、陰性供試品溶液與供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定，得到色譜圖。結(jié)果在與馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚相同保留時(shí)間處，供試品溶液出現(xiàn)對(duì)照品色譜峰，陰性對(duì)照溶液無(wú)該色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對(duì)照無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

1.馬錢苷；2.芍藥苷；3.丹皮酚A.對(duì)照品；B.樣品；C.缺牡丹皮陰性對(duì)照；D.缺山茱萸陰性對(duì)照。圖1 耳聾左慈丸及對(duì)照品HPLC圖

2.5 線性關(guān)系

分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、5、8、10、15、20 μL，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品峰面積Y，對(duì)進(jìn)樣量X(μg)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程馬錢苷：Y=1 601 403X+8988，r=0.999 5。結(jié)果表明，馬錢苷在0.086 72～0.867 2 μg具有良好的線性關(guān)系；芍藥苷：Y=1 261 310X-26 600，r=0.999 9。結(jié)果表明，芍藥苷在0.189 28～1.892 8 μg具有良好的線性關(guān)系；丹皮酚：Y=2 845 476X+25 490，r=0.999 8。結(jié)果表明，丹皮酚在0.171 04～1.710 4 μg具有良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液8 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積。結(jié)果馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積的RSD分別為0.3%、0.6%和0.5%。結(jié)果表明，馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一耳聾左慈丸樣品(批號(hào)：130407)5份，每份1.0 g，按正文方法提取制備并測(cè)量，馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.75、1.09、1.66 mg·g-1，RSD為分別1.2%、1.3%和1.8%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液(批號(hào)：130407)，分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣8 μL，記錄峰面積。結(jié)果馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的峰面積的RSD分別為1.0%、0.9%和0.8%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批樣品(批號(hào)：130407)9份，每份1.0 g，精密稱定，分別精密加入馬錢苷對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度為0.216 8 mg·mL-1)2、3、4 mL、芍藥苷對(duì)照品液(質(zhì)量濃度為0.427 6 mg·mL-1)2、3、4 mL和丹皮酚對(duì)照品液(質(zhì)量濃度為0.473 2mg·mL-1)3、4、5 mL，按正文含量測(cè)定的方法操作。按2.1色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖，計(jì)算馬錢苷平均回收率為99.50%，RSD=0.43%；芍藥苷平均回收率為99.20%，RSD=0.47%；丹皮酚平均回收率為99.27%，RSD=0.31%。結(jié)果見(jiàn)表1～3。

2.10 樣品含量測(cè)定

取3批耳聾左慈丸，精密稱取樣品1 g，按2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表4。

表1 耳聾左慈丸中馬錢苷回收率試驗(yàn)

表2 耳聾左慈丸中芍藥苷回收率試驗(yàn)

表3 耳聾左慈丸中丹皮酚回收率試驗(yàn)

表4 樣品測(cè)定(n=3)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，其分離度、理論塔板數(shù)、峰的對(duì)稱性及出峰時(shí)間均達(dá)到滿意的結(jié)果，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相體系。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)照品溶液用DAD檢測(cè)器進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)馬錢苷最大吸收波長(zhǎng)為236 nm；芍藥苷最大吸收波長(zhǎng)為230 nm；丹皮酚在230、273 nm處均有吸收峰，參考相關(guān)文獻(xiàn)[1，5-9]，并通過(guò)比較，發(fā)現(xiàn)吸收波長(zhǎng)在235 nm時(shí)各峰均有較好的響應(yīng)，并且峰形較好，故選擇在235 nm處測(cè)定較為理想。

3.3 提取條件的選擇

筆者通過(guò)文獻(xiàn)查閱和試驗(yàn)摸索[1，5-9]，考察了馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的最佳提取條件。曾分別用50%甲醇、80%甲醇、甲醇和乙醇為提取溶液，超聲處理60 min，結(jié)果80%甲醇超聲處理60 min提取效率最好，其效果和超聲提取相差無(wú)幾，故選用80%甲醇超聲提取60 min的提取方法。

3.4 結(jié)論

通過(guò)提取條件的優(yōu)化、色譜條件的選擇及系統(tǒng)性試驗(yàn)的考察，說(shuō)明該方法快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可以為提高耳聾左慈丸的質(zhì)量控制提供參考。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：674-675.

[2] 張振榮，劉新年，師允坤，等.耳聾左慈丸治療神經(jīng)性耳鳴、耳聾的臨床觀察[J].山東醫(yī)藥，1999，39(7)：63.

[3] 李冠豪，何新芳，賴新生.針刺風(fēng)市穴治療神經(jīng)性耳鳴耳聾[J].中國(guó)針灸，2006，26(6)：418.

[4] 徐偉，刁復(fù)強(qiáng).馬錢昔對(duì)人體健康的潛在作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊(cè)，1998，25(2)：81-84.

[5] 陳英紅，姜瑞芝，高陽(yáng).HPLC法測(cè)定耳聾左慈丸中馬錢苷和丹皮酚的含量[J].中國(guó)藥事，2007，21(9)：733-735.

[6] 朱山寅.高效液相色譜法測(cè)定耳聾左慈丸中芍藥苷的含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19(1)：46-47.

[7] 陸旋，張星海，黃雪梅.HPLC法測(cè)定耳聾左慈丸中馬錢苷方法研究[J].浙江化工，2010，41(5)：29-31.

[8] 宮淑枝，朱曉威.HPLC法測(cè)定耳聾左慈丸中丹皮酚的含量[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2010，8(12)：48-49.

[9] 張先瑞.HPLC法測(cè)定耳聾左慈丸中馬錢苷的含量[J].國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2007，13(16)：113-115.

Simultaneous Determination of loganin，Paeoniflorin and Paeonol in Erlongzuoci Pills by HPLC

XU Jian1,3，F(xiàn)ANG Chengwu1,2*，DENG Yanmei3

(1.Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230038,China;2.Bozhou Vocational and Technical College，Bozhou 236800,China;3.Chuzhou Institute for Food and Drug Control，Anhui Chuzhou 239000,China)

Objective：To determine the content ofloganin，paeoniflorin and paeonol simultaneously in Erlongzuoci Pills by HPLC.Methods：With gradient elution，Acclaim C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)was used as chromatographic column with the acetonitrile -0.1% phosphoric acid as the mobile phase.The UV wavelength was 235 nm，and the flow rate was 1.0 mL·min-1.Results：The linear range for loganin was 0.086 72-0.867 2 μg，r=0.999 5(n=6).The average recovery was 99.58% and RSD was 0.43%；The linear range for paeoniflorin was 0.189 28-1.892 8 μg，r=0.999 9(n=6).The average recovery was 99.20% and RSD was 0.47%.The linear range for paeonol was 0.171 04-1.710 4 μg，r=0.999 9(n=6).The average recovery was 99.27% and RSD was 0.31%.Conclusion：The established method is simple reliable.

Erlongzuoci Pills；loganin；paeoniflorin；paeonol；HPLC

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.2.015

2014-06-09)

*

方成武，教授，研究方向：中藥資源與質(zhì)量研究；E-mail：cwfang1961@sina.com