秦笑，陳美娟

(1.南京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)(2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

·基礎研究·

楊梅素影響 EA.hy926 人血管內(nèi)皮細胞增殖、侵襲遷移及微管形成的實驗研究△

秦笑1，陳美娟2*

(1.南京中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，江蘇 南京 210023)(2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023)

目的：探討楊梅素抗腫瘤血管新生的作用機制。方法：用不同濃度的楊梅素作用于體外培養(yǎng)的 EA.hy926 人血管內(nèi)皮細胞株，采用MTT 法觀察藥物對細胞的增殖抑制作用，劃痕法及transwell小室實驗觀察藥物對細胞侵襲遷移能力的影響，tube formation 法觀察藥物對微管形成的影響。結果：楊梅素對EA.hy926細胞的增殖、侵襲遷移及血管生成呈濃度依賴性抑制，尤其在高濃度下(1 mM)其抑制作用最顯著(P<0.01)。結論：楊梅素的抗腫瘤血管生成作用不僅通過抑制內(nèi)皮細胞的增殖，而且通過抑制內(nèi)皮細胞的侵襲遷移及微管樣結構的形成來實現(xiàn)。

楊梅素；血管內(nèi)皮細胞；增殖；侵襲/遷移；血管生成

楊梅素(myricetin)化學名為3，5，7，3′，4′，5′-六羥基黃酮，是一種重要的黃酮醇類化合物，廣泛存在于多種天然植物中?，F(xiàn)代藥理學研究表明，其具有廣泛的藥理活性。據(jù)報道，楊梅素可以通過抑制腫瘤細胞的生長與增殖、促進其凋亡等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[1-3]，但楊梅素對腫瘤血管新生的抑制作用少有報道。

本研究用不同濃度的楊梅素對人血管內(nèi)皮細胞株EA.hy926進行干預，通過MTT法、 transwell小室法、tube formation法等體外實驗觀察楊梅素對細胞增殖、侵襲遷移及微管形成的影響，進一步探討楊梅素抗腫瘤血管生成作用的機理。

1 材料

1.1 細胞株

EA.hy926人血管內(nèi)皮細胞株購于蘇州大學醫(yī)學部，培養(yǎng)于含有10%的胎牛血清、1%的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩種液(HEPES)、青霉素(50 IU·mL-1)、鏈霉素(100 U·mL-1)的1640培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

楊梅素購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度>99%，二甲亞砜(DMSO)助溶，1640 培養(yǎng)基稀釋至所需濃度(DMSO的終濃度<0.3%)，抽濾除菌。1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)；Transwell小室(Corning公司)；胰酶、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術研究所)。

兔抗人MMP-2、MMP-9多克隆抗體(北京博奧森生物有限公司)；鼠尾膠原蛋白(杭州生友生物技術公司)；Matrigel(BD公司)。

2 方法

2.1 MTT法檢測楊梅素對EA.hy926細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的細胞，胰酶消化后細胞計數(shù)，接種于96孔板，每孔加200 μL細胞懸液(含3×103個細胞)，常規(guī)培養(yǎng)過夜，至細胞貼壁，換上梯度濃度分別為0.01、0.1、1 mmol·L-1的含藥培養(yǎng)基，并設空白對照組。每個劑量設6個平行復孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加質量濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清后每孔加DMSO 200 μL，振蕩器振蕩10 min后，酶標儀(美國 BIO-TEK 公司)測定490 nm的吸光度，重復3次。

2.2 Transwell小室侵襲實驗

將細胞消化后用0.1%牛血清白蛋白(BSA)重懸，細胞(1×106)以每孔100 μL種入transwell小室，加藥刺激，小室外部空間加入600 μL含10%小牛血清的完全培養(yǎng)基作為化學趨化劑。置5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)6 h。取出transwell，用棉簽小心將小室膜上表面細胞去除，取下膜，自然風干。甲醇固定5 min，用HE染色法進行染色，蘇木素染色10 min，分色劑中浸泡數(shù)秒，再投入伊紅染色2 min，分別用50%、70%、80%、95%、100%乙醇脫水數(shù)秒，二甲苯透明，中性樹脂封片。下表面細胞經(jīng)染色后，顯微鏡下觀察、照相，隨機取5個視野計數(shù)，計算遷移率。

2.3 楊梅素對血管內(nèi)皮細胞管腔形成的影響

鼠尾膠原蛋白凝膠的制備(以1 mL為例)：取200 μL鼠尾膠原蛋白，置于冰浴的離心管中，加入690 μL蒸餾水，立即混勻，加入到含12 μL濃度為0.1 mol·L-1的氫氧化鈉(NaOH)溶液中，混勻，再加入100 μL的10×PBS，混勻，每孔100 μL種于96孔板。先置于25 ℃ 20 min，再置于37 ℃過夜。將細胞消化，重懸，調整細胞濃度為2×105，每孔100 μL種于凝膠上，含終濃度分別為0.01、0.1、1 mmol·L-1的藥物。孵育12 h，觀察小管形成情況。

2.4 明膠酶譜法檢測楊梅素對血管內(nèi)皮細胞分泌MMP2、MMP9的影響

取對數(shù)生長期的細胞，以2×105個/孔的密度接種于24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，加入含不同濃度楊梅素的無血清培養(yǎng)液300 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集藥物作用后細胞的無血清培養(yǎng)液，以12 000 rpm離心5 min，除細胞碎片，收集上清，立即使用或-70 ℃保存。BCA法進行蛋白濃度測定，根據(jù)蛋白濃度分別取相應的上清，與等量的上樣緩沖液混合，進行SDS-PAGE凝膠電泳。制備10%分離膠和5%濃縮膠，分離膠中加入終濃度為0.32 mg·mL-1的明膠，以80 V電泳至溴酚藍前沿進入分離膠，加壓至110 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍前沿至凝膠前端約1 cm，停止電泳、剝膠，用蒸餾水漂洗數(shù)次后，移入100 mL 2.5%TritonX-100溶液中，在搖床上低速搖動，以洗脫SDS。0.5 h后，用蒸餾水漂洗，換新的TritonX-100溶液，繼續(xù)洗脫0.5～l h。用蒸餾水漂洗后，加100 mL明膠酶緩沖液，在37 ℃恒溫溫育42 h。凝膠用蒸餾水漂洗后，放入染色液(0.05%考馬斯亮蘭R-250，以甲醇-水-冰醋酸=45∶45∶10溶解)中，染色4 h，漂洗后，在脫色液(甲醇-水-冰醋酸=45∶45∶10)中脫色1～2 h，至對照出現(xiàn)清晰的負染酶帶，在凝膠成像儀中照相，觀察條帶變化。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 楊梅素對EA.hy926細胞增殖的影響

MTT法觀察不同濃度的楊梅素對EA.hy926血管內(nèi)皮細胞增殖的影響，結果顯示，與對照組相比，濃度分別為0.01、0.1、1 mmol·L-1的楊梅素作用細胞24 h后，對EA.hy926細胞的增殖均有抑制作用，其中以1 mmol·L-1的藥物抑制最為顯著(P< 0.01)，見圖1。

注：與對照組相比**p< 0.01。圖1 不同濃度楊梅素對EA.hy926細胞生長的抑制率(n=6)

3.2 transwell實驗檢測楊梅素對EA.hy926細胞侵襲能力的影響

transwell小室實驗檢測楊梅素對EA.hy926細胞侵襲能力的改變，結果發(fā)現(xiàn)，楊梅素處理后，EA.hy926細胞的侵襲能力下降，且呈劑量依賴性。濃度分別為0、0.01、0.1、1 mmol·L-1的楊梅素處理各組遷移過膜的細胞數(shù)分別為(171±13.4)、(76.8±9.19)、(47.2±2.9)、(34.4±5.5)，各濃度組與陰性對照組間差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05)，其中1 mmol·L-1處理組與陰性對照組之間差異極具統(tǒng)計學意義(p<0.01)。見圖2。

注：A.Control；B.0.01 mmol·L-1；C.0.1 mmol·L-1；D.1 mmol·L-1。下同。圖2 楊梅素對細胞遷移實驗的影響

3.3 楊梅素對血管內(nèi)皮細胞管腔形成的影響

楊梅素濃度為0的陰性對照組和0.01 mmol·L-1的處理組在12 h時均已出現(xiàn)微管樣結構，并隨著時間延長逐漸顯著；而濃度為0.1、0.01 mmol·L-1處理組典型的微管樣結構明顯減少。見圖3。

圖3 不同濃度楊梅素對EA.hy926細胞微管形成的影響

3.4 明膠酶譜實驗

明膠酶譜法檢測結果顯示，在楊梅素處理細胞24 h后，其高劑量組(1 mmol·L-1)對MMP-2和MMP-9的酶解條帶都有顯著抑制作用，尤其是對MMP-9的抑制作用更顯著。見圖4。

圖4 明膠酶譜法檢測不同濃度的楊梅素對EA.hy926細胞MMP-2、MMP-9表達的影響

4 討論

當腫瘤的生長超過一定體積后，必須有新的血管為其提供氧氣和營養(yǎng)，并帶走代謝產(chǎn)物，否則腫瘤的生長將處于休眠狀態(tài)。腫瘤血管生成是指腫瘤細胞誘發(fā)的毛細血管新生以及腫瘤中微循環(huán)網(wǎng)的形成，為實體瘤的后續(xù)生長提供物質基礎?；诖死碚摚寡苌傻闹委煵呗猿蔀槟[瘤治療的熱點方向之一。

腫瘤新生血管的生成過程及調控機制十分復雜，其基本過程包括內(nèi)皮細胞被腫瘤細胞及其支持細胞分泌的趨化因子募集至腫瘤部位后，在各種生長因子的作用下大量增殖并相互黏附，重排組成血管。在此過程中，內(nèi)皮細胞的遷移能力、到達新生部位后的增殖能力及血管形成能力是有關腫瘤新生血管形成的幾個重要因素[4-5]。

本研究選擇EA.hy926血管內(nèi)皮細胞作為研究對象，通過觀察楊梅素對其增殖能力、侵襲遷移能力及血管形成能力的影響，評價楊梅素對腫瘤新生血管形成的抑制作用。研究結果表明，楊梅素在高劑量下，即1 mmol·L-1的劑量下對EA.hy926血管內(nèi)皮細胞的增殖、侵襲遷移及微管生成具有顯著的抑制作用。

另外，在內(nèi)皮細胞降解并穿透血管與腫瘤間基質，到達腫瘤部位的過程中，基質金屬蛋白酶(Matrix metallopeptidases，MMPs)降解細胞外基質是重要的一環(huán)。明膠酶譜實驗檢測結果表明，高劑量(1 mmol·L-1)的楊梅素對MMP-9和MMP-2的蛋白水平均有顯著的抑制作用。

綜上所述，楊梅素在較高的劑量下能通過抑制細胞的增殖、侵襲遷移及微管形成起到抗腫瘤新生血管形成的作用。

[1] 林國鋇，謝燕，李國文.楊梅素的研究進展[J].國際藥學研究雜志，2012，39(6)：483-487.

[2] 代雄，顏杰寬，甘秀海.黃酮類化合物研究進展[J].貴州師范學院學報，2013，29(9)：302-306.

[3] Deeba N S，Vaqar M A，Mohammad I K，et al.Inhibition ofAkt/mTOR signaling by the dietary flavonoid fisetin[J].Anticancer Agents Med Chem，2013，13(7)：995-1001.

[4] 陳信義，徐力，張燕明，等.惡性腫瘤新生血管研究進展[J].癌癥進展雜志，2005，3(6)：528-533.

[5] 趙黎明，徐寒梅，奚濤.腫瘤血管生成及其抑制劑研究進展[J].藥物生物技術，2010，17(5)：457-461.

InhibitoryEffectsofMyricetinonAngiogenesisofHumanEA.hy926cells

QINXiao1，CHENMeijuan2*

(1.ThePre-clinicalMedicineCollege，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China；2.JiangsuCollaborativeInnovationCenterofTraditionalChineseMedicine(TCM)PreventionandTreatmentofTumor，NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210023，China)

Objective：To explore the inhibition effects of myricetin on angiogenesis of human EA.hy926 cellsin vitro.Methods：MTT assay，transwell assay and matrigel tube-formation assay were used to detect the effects of myricetin on the proliferation，invasion and tube-formation of EA.hy926 cells.Gelatin zymography assay was used to detect the effects of myricetin on the enzyme activities of matrix metalloproteinase-2(MMP-2)and matrix metalloproteinase-9(MMP-9).Results：At the concentration of 1 mmol/L，myricetin effectively inhibited the proliferation，invasion and tube-formation of EA.hy926 cells(P<0.01).Conclusion：Myricetin inhibits angiogenesis of EA.hy926 cells mainly through inhibiting the proliferation，invasion and tube-formation in EA.hy926 cells.

Myricetin；EA.hy926 cells；proliferation；invasion；angiogenesis

2015-02-28)

江蘇省高校優(yōu)勢學科建設工程項目(PAPD)；江蘇自然基金(BK20131415)；歐盟第七框架項目(PIRSES-GA-2013-612589)

*

陳美娟，博士，副教授，研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤及其機制；E-mail：mjchen9680@sina.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.5.007