張立國(guó)，趙麗麗，倪力軍*，吳婷婷，史萬(wàn)忠

(1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

·基礎(chǔ)研究·

腰痛寧膠囊有效部位組合對(duì)IL-1β誘導(dǎo)大鼠滑膜細(xì)胞增殖及IL-6的影響△

張立國(guó)1，趙麗麗1，倪力軍1*，吳婷婷1，史萬(wàn)忠2

(1.華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237；2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 附屬曙光醫(yī)院，上海 200021)

目的：研究腰痛寧膠囊組方有效部位的不同組合對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠滑膜細(xì)胞異常增殖和對(duì)細(xì)胞因子IL-6分泌的影響，以及各有效部位之間的相互作用關(guān)系。方法：大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364體外培養(yǎng)傳至第2代后，加入腰痛寧拆方及全方共計(jì)6個(gè)腰痛寧有效部位組合樣品，培養(yǎng)48 h，采用CCK-8以及ELISA法分別測(cè)定滑膜細(xì)胞增殖及IL-6分泌水平。結(jié)果：6個(gè)腰痛寧拆方及組方樣品均能夠抑制滑膜細(xì)胞異常增殖以及IL-6的分泌，腰痛寧全方的綜合活性最佳且其有效部位間存在很強(qiáng)的協(xié)同作用。結(jié)論：腰痛寧膠囊可有效抑制大鼠滑膜炎，對(duì)滑膜細(xì)胞具有一定保護(hù)作用，腰痛寧膠囊的藥引黃酒對(duì)于腰痛寧處方中有效部位的細(xì)胞活性有重要的促進(jìn)作用。但可在保證藥效前提下減少組方中藥或有效部位種類對(duì)腰痛寧處方進(jìn)行精簡(jiǎn)優(yōu)化，以增強(qiáng)其質(zhì)量可控性與安全性。

腰痛寧膠囊；類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；細(xì)胞增殖；IL-6；滑膜細(xì)胞

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthrits，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性自身免疫功能障礙性疾病，滑膜細(xì)胞的過(guò)度增生以及大量炎癥因子的形成會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞[1]。白介素-6(interleukin-6，IL-6)的過(guò)量分泌是RA病理作用之一，因此，抑制細(xì)胞的異常增殖，以及有效封鎖IL-6可控制RA病情的發(fā)展[2-3]。腰痛寧是一個(gè)有幾十年臨床應(yīng)用歷史的中藥復(fù)方制劑，由馬錢子粉(調(diào)制)、土鱉蟲、麻黃、乳香、沒(méi)藥、川牛膝、全蝎、僵蠶、蒼術(shù)、甘草組成，使用時(shí)用黃酒兌少量溫開水服用[4]，用于腰腿疼、腰肌勞損和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[5]。腰痛寧處方中眾多的組方中藥給其藥理研究帶來(lái)很大困難。本課題組前期采用細(xì)胞模型研究了含腰痛寧有效部位在內(nèi)的中藥有效部位組合樣品的免疫、抗炎和軟骨細(xì)胞修復(fù)活性，并對(duì)樣品中有效部位間的相互作用類型進(jìn)行了分析，結(jié)果表明腰痛寧全方具有修復(fù)骨性關(guān)節(jié)炎對(duì)軟骨造成的損傷[6-7]、良好的抗炎活性[8-9]與細(xì)胞免疫活性[10]，在這些藥理模型下腰痛寧全方中各有效部位間存在協(xié)同或疊加作用。

本文利用IL-1β誘導(dǎo)大鼠滑膜細(xì)胞建立體外類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理模型[11]，探究腰痛寧不同有效部位組合樣品對(duì)滑膜細(xì)胞增殖及細(xì)胞中IL-6水平的影響，從細(xì)胞藥理角度研究腰痛寧有效部位組合對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀區(qū)中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng))。

1.2 藥物

制馬錢子(批號(hào)：Y302-09091-10)、蒼術(shù)(批號(hào)：Y002-101001-2)、麻黃(批號(hào)：Y412-100601-12)、土鱉蟲(批號(hào)：Y803-110101-5)、川牛膝(批號(hào)：Y012-110401-1)、僵蠶(批號(hào)：Y805-1011054)、甘草(批號(hào)：Y013-110301-1)、乳香(批號(hào)：110301-2)、沒(méi)藥(批號(hào)：110401-1)、全蝎(批號(hào)：Y804-11302-4)、黃酒(批號(hào)：291110)，均由頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，經(jīng)該公司執(zhí)業(yè)藥師王春民鑒定，樣本保存于華東理工大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，各有效部位的提取及質(zhì)量分析方法見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)室前期工作報(bào)道[6]。按照各有效部位對(duì)應(yīng)中藥在腰痛寧中的投料量，將黃酮、皂苷、揮發(fā)油(含水提液)、多糖、黃酒提取物等活性部位依次加入馬錢子與麻黃生物堿中，制備6個(gè)腰痛寧拆方及全方樣品。樣品Ⅰ：馬錢子生物堿-麻黃生物堿混合物(1∶16)，生物堿混合物簡(jiǎn)稱A；樣品Ⅱ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮(1∶16∶3)，甘草黃酮簡(jiǎn)稱F；樣品Ⅲ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷(1∶16∶3∶5∶1)，皂苷類混合物簡(jiǎn)稱S；樣品Ⅳ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-沒(méi)藥揮發(fā)油-乳香揮發(fā)油-蒼術(shù)揮發(fā)油-土鱉蟲水提液-僵蠶水提液-全蝎水提液(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7)，揮發(fā)油/水提物混合物簡(jiǎn)稱Ⅴ；樣品Ⅳ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-沒(méi)藥揮發(fā)油-乳香揮發(fā)油-蒼術(shù)揮發(fā)油-土鱉蟲水提液-僵蠶水提液-全蝎水提液-川牛膝多糖-甘草多糖-蒼術(shù)多糖-麻黃多糖(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7∶5∶7∶2∶3)，多糖類混合物簡(jiǎn)稱P；樣品Ⅵ：麻黃生物堿-馬錢子生物堿-甘草黃酮-甘草皂苷-川牛膝皂苷-沒(méi)藥揮發(fā)油-乳香揮發(fā)油-蒼術(shù)揮發(fā)油-土鱉蟲水提液-僵蠶水提液-全蝎水提液-川牛膝多糖-甘草多糖-蒼術(shù)多糖-麻黃多糖-黃酒提取物(1∶16∶3∶5∶1∶4∶4∶3∶7∶7∶7∶5∶7∶2∶3∶1)，黃酒提取物簡(jiǎn)稱Crw。

1.3 試劑

磷酸鹽緩沖液片劑(PBS Tablets，瑞典Medicago AB公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基，0.25% 胰酶，雙抗(鏈霉素與青霉素)，兩性霉素(美國(guó)Biowest公司)；Rat IL-1素(以色列PROSPEC公司)；小牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司)；大鼠IL-6 ELISA試劑盒(美國(guó)RD System公司)；CCK8試劑盒(日本同仁化學(xué))。

1.4 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(cell 150，德國(guó)Heraeus公司)；倒置顯微鏡(CKX41，日本OLYMPUS公司)；TXZ-92B臺(tái)式恒溫振蕩器(上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；離心機(jī)(TDZ4-WS，湖南賽特湘儀)；生物安全柜(美國(guó)LABCONCO公司)；酶標(biāo)儀(EL-340，意大利Bioteck公司)；分析天平(瑞士METTER TOLEDO公司)；恒溫磁力攪拌器(上海司樂(lè)儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵(上海予華儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)；數(shù)顯調(diào)節(jié)儀(余姚新波儀器公司)；真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；超聲儀(上海生析超聲儀器有限公司)。

2 方法

2.1 受試樣品配置

首先精密稱取各中藥有效部位，將具有熱穩(wěn)定性的有效部位置于燒杯中，加入適量PBS緩沖液，攪拌使之初步溶解，沸水浴加熱10 min，待其完全溶解后冷卻并加入熱不穩(wěn)定性有效部位進(jìn)行混合。將腰痛寧拆方及全方樣品Ⅰ-Ⅵ分別超聲20 min，冷卻，定容，配成2500 mg·L-1母液，0.22 μm濾膜過(guò)濾并稀釋至各濃度(9.77、4.88、2.44、1.22、0.61、0.31、0.15、0.08 mg·L-1)，備用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠滑膜細(xì)胞株RSC-364，待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)，傳至第2代時(shí)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)用于實(shí)驗(yàn)。每孔接種200 μL細(xì)胞懸液，接種24 h后把培養(yǎng)孔分為空白對(duì)照組、IL-1β對(duì)照組、受試樣品組，每樣3復(fù)孔，分別更換相應(yīng)的培養(yǎng)液：空白對(duì)照組換DMEM(含5%FBS、0.02%聚山梨酯-80)，模型組換DMEM(含10 μg·L-1的IL-1β、0.02%聚山梨酯-80及5%FBS)，受試藥物換DMEM(含10 μg·L-1的IL-1β、0.02%聚山梨酯-80、5%FBS及各濃度藥物)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

2.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)

于96孔板進(jìn)行檢測(cè)，去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK8溶液(含100 μL全培養(yǎng)基及10 μL CCK8試劑)，繼續(xù)孵育，于給藥后3 h置于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的光密度值(OD值)，并換算半數(shù)抑制濃度(IC50)，除此之外，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線將OD換算成細(xì)胞數(shù)，對(duì)各受試樣品抑制增殖作用進(jìn)行分析與比較。

2.4 細(xì)胞上清液中的IL-6的測(cè)定

取前述增殖細(xì)胞中原細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，于96孔板進(jìn)行檢測(cè)，全流程嚴(yán)格按照RD ELISA IL-6試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行，使用酶標(biāo)儀測(cè)得吸光度(A)，需將IL-6分泌水平根據(jù)對(duì)應(yīng)的細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行歸一化處理，獲得單個(gè)細(xì)胞IL-6釋放量。最后，將IL-6值通過(guò)計(jì)算換算為IC50，分析及比較各樣品對(duì)滑膜細(xì)胞上清液內(nèi)IL-6水平的影響。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法[6-10]

所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以半數(shù)抑制濃度(IC50)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，該值為各指標(biāo)抑制率達(dá)到50%所對(duì)應(yīng)的藥物濃度，由各樣品量效曲線結(jié)合Origin7.5軟件作圖得到，數(shù)據(jù)則通過(guò)SPSS18.0進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了判斷各有效部位之間是協(xié)同、疊加還是拮抗作用，本文通過(guò)比較樣品的IC50實(shí)驗(yàn)值與樣品中各有效部位IC50的疊加值間的差異來(lái)判斷有效部位間的相互作用關(guān)系。具體方法如下：首先，定義第i個(gè)有效部位在樣品j中的所占的質(zhì)量比為Xij，該有效部位的IC50值記為IC50(i)，將樣品j中每個(gè)有效部位IC50與其在樣品中的質(zhì)量比Xij乘積的和稱為樣品j的IC50疊加值，記為IC50(Aj)，即

IC50(Aj)=∑iXijIC50(i)

(1)

將樣品j的實(shí)驗(yàn)IC50值記作IC50(Ej)、其標(biāo)準(zhǔn)差記為SD(j)。假設(shè)樣品j中的各有效部位間不存在相互作用，則IC50(i)可通過(guò)求解obj的極小值獲得：

obj=‖∑iXijIC50(i)-IC50(Ej)‖

(2)

1)若IC50(Ej)-SD(j)﹥IC50(Aj)，即樣品j中有效部位IC50的疊加值小于實(shí)驗(yàn)IC50值，說(shuō)明各有效部位間發(fā)生了拮抗作用；

2)若IC50(Ej)+SD(j)﹤IC50(Aj)，即樣品j中有效部位IC50的疊加值大于實(shí)驗(yàn)IC50值，說(shuō)明各有效部位間發(fā)生了協(xié)同作用；

3)若IC50(Ej)-SD(j)﹤IC50(Aj)﹤IC50(Ej)+SD(j)，即樣品j中有效部位的疊加值在IC50的波動(dòng)范圍內(nèi)，說(shuō)明各有效部位間存在疊加作用。

以上計(jì)算過(guò)程通過(guò)在MATLAB 2012b的自編程序?qū)崿F(xiàn)，詳細(xì)代碼見(jiàn)文獻(xiàn)的補(bǔ)充材料[8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 各有效部位對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞增殖以及IL-6水平的影響

采用2.5所述方法計(jì)算得到的腰痛寧組方中15個(gè)有效部位抑制病理滑膜細(xì)胞增殖的IC50值以及IL-6的IC50值，見(jiàn)表1。各有效部位的IC50值與其在組方樣品中所占的比例的乘積加和，可求得I～VI號(hào)樣品的IC50疊加值。

表1 腰痛寧各有效部位抑制滑膜細(xì)胞增殖以及IL-6水平的IC50 /mg·L-1

3.2 各腰痛寧樣品對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，腰痛寧拆方與全方6個(gè)樣品對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞過(guò)度增殖均顯示出抑制作用。其中有兩種生物堿組成的拆方樣品Ⅰ作用最佳，其次是拆方樣品Ⅳ及全方樣品Ⅵ，三者之間無(wú)顯著差異。這與文獻(xiàn)報(bào)道馬錢子生物堿對(duì)包括滑膜細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞增殖具有良好的抑制作用一致[12-13]。比較樣品Ⅱ與樣品Ⅰ、樣品Ⅴ與樣品Ⅳ，發(fā)現(xiàn)甘草黃酮、總多糖加入后的組方抑制滑膜細(xì)胞增殖作用顯著降低；比較樣品Ⅳ與樣品Ⅲ、樣品Ⅵ與樣品Ⅴ后，發(fā)現(xiàn)加入揮發(fā)油/水提物、黃酒提取物后的組方抑制滑膜細(xì)胞增殖的作用顯著提高。

將各樣品的實(shí)驗(yàn)IC50值與其IC50疊加值進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，Ⅰ號(hào)、Ⅳ號(hào)與Ⅵ號(hào)樣品的IC50(Ej)+SD(j)大大低于其IC50(Aj)，說(shuō)明這3個(gè)樣品中的各有效部位之間發(fā)生了很強(qiáng)的協(xié)同作用，使得這3個(gè)樣品的實(shí)驗(yàn)IC50值在6個(gè)樣品中偏低；而Ⅱ號(hào)樣品的IC50(Ej)-SD(j)﹤IC50(Aj)﹤IC50(Ej)+SD(j)，說(shuō)明Ⅱ號(hào)樣品的甘草黃酮與馬錢子生物堿以及麻黃生物堿間發(fā)生了疊加作用；Ⅴ號(hào)樣品的IC50(Ej)-SD(j)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于IC50(Aj)，說(shuō)明該樣品的各有效部位之間存在極強(qiáng)的拮抗作用，因而Ⅴ號(hào)樣品的IC50為6個(gè)樣品中最高。Ⅲ號(hào)樣品的IC50(Ej)-SD(j)略大于其疊加IC50(Aj)，表明該樣品有效部位(生物堿、黃酮、皂苷)間有微弱的拮抗作用，且Ⅳ號(hào)樣品的實(shí)驗(yàn)IC50顯著低于Ⅲ號(hào)樣品的IC50，表1結(jié)果說(shuō)明揮發(fā)油/水提物抑制滑膜細(xì)胞增殖的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其他有效部位，加上該部位與腰痛寧組方中藥生物堿、黃酮、皂苷間的協(xié)同作用，使得揮發(fā)油/水提物加入組方Ⅲ后得到的樣品Ⅳ抑制滑膜細(xì)胞增殖的活性得到顯著提高。

注：與Ⅰ相比，☆P<0.01；與Ⅲ相比，★P<0.05；與Ⅳ相比，#P<0.01；與Ⅴ相比，▲P<0.01；與Ⅵ相比，*P<0.05，**P<0.01。圖1 腰痛寧拆方及全方樣品對(duì)滑膜細(xì)胞增殖的影響

3.3 各腰痛寧樣品對(duì)IL-6分泌水平的影響

圖2列出了腰痛寧拆方與全方樣品對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的滑膜細(xì)胞上清液中IL-6水平影響的半數(shù)抑制濃度實(shí)驗(yàn)值與疊加值。6個(gè)樣品對(duì)病理滑膜細(xì)胞上清液中IL-6的分泌均有不同程度的抑制作用。其中，Ⅳ號(hào)樣品的作用最為顯著，Ⅴ號(hào)與Ⅵ號(hào)方次之，三者之間的IC50沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Ⅰ號(hào)樣品由馬錢子與麻黃兩種生物堿組成，其IC50(Ej)+SD(j)

注：與Ⅰ相比，☆P<0.01；與Ⅱ相比，★P<0.01；與Ⅲ相比，△P<0.01；與Ⅵ相比，*P<0.01。圖2 腰痛寧拆方及全方樣品對(duì)滑膜細(xì)胞上清液中IL-6分泌水平的影響

4 結(jié)論

本文研究的6個(gè)腰痛寧膠囊組方有效部位組合樣品均對(duì)大鼠RA滑膜細(xì)胞炎癥有一定的抑制作用，主要表現(xiàn)在對(duì)異常增生滑膜細(xì)胞的抑制作用及下調(diào)炎癥因子IL-6的表達(dá)，從而抑制炎性滑膜細(xì)胞的炎性反應(yīng)。腰痛寧組方中藥中的揮發(fā)油/水提物及腰痛寧藥引黃酒具有良好的促進(jìn)腰痛寧有效部位組合樣品抑制病理滑膜細(xì)胞增殖和滑膜細(xì)胞炎癥的作用。其中腰痛寧全方樣品Ⅵ在兩個(gè)滑膜細(xì)胞模型中均具有很好的藥理活性，從滑膜細(xì)胞藥理角度證明了腰痛寧膠囊的療效及處方的合理性。從精簡(jiǎn)處方、提高藥物質(zhì)量可控性與安全性的角度而言，腰痛寧處方仍有一定的優(yōu)化空間，如以Ⅲ號(hào)或Ⅳ號(hào)樣品為基礎(chǔ)減少腰痛寧處方的中藥或有效部位種類，可為開發(fā)風(fēng)濕骨病中藥新藥提供新的候選藥物。

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Inhibition Effect of Active Fractions in Yaotongning Capsules on IL-1β-induced Synovial Cell Proliferation and IL-6Production

ZHANG Liguo1，ZHAO lili1，NI Lijun1*，WU Tingting1，SHI Wanzhong2

(1.School of Chemistry and Molecular Engineering，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China；2.Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of TCM，Shanghai 200021，China)

Objective：To evaluate theinvitroeffects and interactions of active fractions in Yaotongning Capsule (YTNC) by detecting proliferation of interleukin-6 (IL-6) and secretion of rat synovial cell-364 (RSC-364)induced by interleukin-1β(IL-1β).Methods：Six samples including YTNC disassembled prescriptions and the YTNC whole recipe were added to the second generation of culturing RSC-364.After culturing the system for 48 hours，the proliferations of synovial cells and interleukin-6 were examined by cell counting kit-8 (CCK8) assay and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)，respectively.Results：The YTNC whole recipe and YTNC disassembled prescriptions successfully inhibited abnormal proliferation of IL-1β-induced synovial cells，as well as the secretion of IL-6.The YTNC whole recipe showed the best integrated activity among the six samples，and strong synergistic effect was observed among the active fractions of the YTNC whole recipe.Conclusion：YTNC prescription can inhibit rat synovitis deterioration and protect synovial cells to some degree.Moreover，the effects of the combination of YTNC material medicines’ active fractions on the investigated cell activities are obviously stimulated by YTNC’s vehicle，Chinese rice wine.However，in order to improve quality controllability and safety of YTNC without decreasing its efficacy，the categories of material medicines and active fractions in YTNC could still be reduced to get more simple prescriptions.

Yaotongning Capsule；rheumatoid arthritis；proliferation；IL-6；synovial cells

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.9.010

2014-11-17)

上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)支撐項(xiàng)目(13401901100)

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倪力軍，博士，教授，研究方向：天然藥物研究；Tel：(021)64253045，E-mail：nljfyt@163.com