梁　艷，牛扶幼，范海霞，張智棋

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科河南鄭州450052）

WWOX及P73蛋白在皮膚惡性黑色素瘤中的表達(dá)及意義

梁艷，牛扶幼，范海霞，張智棋

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形外科河南鄭州450052）

目的：探討WW結(jié)構(gòu)域氧化還原酶基因（WW domain-containing oxidoreductase gene，WWOX）與P73蛋白在皮膚惡性黑色素瘤（cutaneous malignant melanoma，CMM）中的表達(dá)及其意義。方法：采用免疫組化法（SP）檢測(cè)66例CMM、30例交界痣和20例正常皮膚組織蠟塊中的WWOX、P73蛋白表達(dá)水平。使用SPSSl7.0統(tǒng)計(jì)軟件包，采用卡方檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)a=0.05，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，χ2分割檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)0.0167。結(jié)果：WWOX在正常皮膚的表達(dá)水平明顯高于交界痣，其在交界痣的表達(dá)水平明顯高于在CMM中的表達(dá)（P＜0.0167）；CMM中WWOX的表達(dá)水平隨腫瘤浸潤(rùn)深度的增加而降低，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)水平低于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。P73蛋白在正常皮膚的表達(dá)水平低于交界痣，其在交界痣的表達(dá)水平低于CMM（P＜0.0167）；CMM中的P73蛋白表達(dá)水平隨腫瘤浸潤(rùn)深度的增加而增高，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)水平高于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)水平（P＜0.05）。WWOX與P73蛋白在CMM中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.298，P=0.015）。結(jié)論：WWOX與P73共同參與調(diào)控CMM的發(fā)生發(fā)展，對(duì)其進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，有助于CMM的早期診斷，為臨床治療提供參考指標(biāo)，同時(shí)也為CMM的基因治療提供一個(gè)新思路。

皮膚惡性黑色素瘤；WW結(jié)構(gòu)域氧化還原酶基因；P73蛋白

皮膚惡性黑色素瘤（CMM），是致死率位居皮膚腫瘤之首的源于皮膚黑色素細(xì)胞的高度惡性腫瘤。近年來我國(guó)CMM的發(fā)病率顯著增加，病死率也隨之增加［1］。研究表明CMM的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，以癌基因的激活和抑癌基因的失活為主要發(fā)生機(jī)制之一［2］。WWOX基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一個(gè)可能的腫瘤抑制基因，跨越了整個(gè)常見染色體脆性位點(diǎn)FRAl6D，在許多人類惡性腫瘤中表達(dá)減少或缺失［3］。P73是法國(guó)Kaghad科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的P53家族的一個(gè)成員，定位于人類1號(hào)染色體短臂著絲粒1p36.33區(qū)域。P73自發(fā)現(xiàn)之日起一直被認(rèn)為是抑癌基因，但是近些年多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)腫瘤中的P73高表達(dá)、雙等位基因、突變少，故產(chǎn)生這樣的疑問：P73在CMM的發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用還是抑制作用。筆者應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)了CMM組織中WWOX和P73的表達(dá)，旨在探討它們?cè)贑MM發(fā)生發(fā)展中的意義及相互關(guān)系［4］。

1　資料和方法

1.1臨床資料

本實(shí)驗(yàn)采用回顧性研究方法，標(biāo)本來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2009年1月-2013年9月存檔于病理科的蠟塊：皮膚惡性黑色素瘤66例，交界痣20例。66例CMM中男性：36例，女性30例，年齡集中在28～64歲，平均（54.69.6）歲；病變部位見于足底、手指甲下、下肢，病程3～15月；依據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（以前哨淋巴結(jié)活檢結(jié)果劃分）將皮膚惡性黑色素瘤患者分為：伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，未伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例；按照腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)深度Clark分級(jí)法分為：15例為I級(jí)：表皮及附屬器上皮，19例為II～I(xiàn)II級(jí)：真皮乳頭層，21例為Ⅳ級(jí)：真皮網(wǎng)狀層，11例V級(jí)：侵及皮下組織。30例交界痣中男性：19例，女性11例，年齡集中在26～58歲，平均年齡為（40.68.9）歲，病變部位見于足部、手掌、面部，病程為3月～50年。以本院整形外科手術(shù)中剩余的20例全厚皮片作為對(duì)照組。所有以上實(shí)驗(yàn)對(duì)象均具備完整的病歷資料，均不伴有結(jié)蹄組織病、皮膚病、免疫缺陷等其他相關(guān)疾病，術(shù)前均未行如下治療：液氮冷凍、射線照射、激光等其他相應(yīng)治療，且各組患者的病變部位、病程、性別和年齡等之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2試劑和方法

濃縮型兔抗人WWOX單克隆抗體購(gòu)買自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，抗體稀釋濃度為1:100；濃縮型兔抗人MDM2單克隆抗體購(gòu)買自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，抗體稀釋濃度為1:100，以染色陽(yáng)性的CMM組織切片做陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3染色結(jié)果判斷

黃色顆粒至棕黃色顆粒的WWOX蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿：P73蛋白集中表達(dá)于胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒。本實(shí)驗(yàn)染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參照Feomowitz陽(yáng)性細(xì)胞半定量分級(jí)法。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡下視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。①根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞面積進(jìn)行分級(jí)，視野為0分的呈陰性，1分的視野為：陽(yáng)性細(xì)胞面積/細(xì)胞總面積＜25%，2分的視野為：26%～50%，3分的視野為：51%～75%，4分的視野＞75%的視野；②根據(jù)著色強(qiáng)弱進(jìn)行分級(jí)，0分的視野不著色，1分的視野與背景色一致，2分的視野呈淺黃色，3分的視野呈深黃色，4分的視野呈棕黃色。兩者定性分乘積為0～1分表達(dá)陰性，≥2分為陽(yáng)性表達(dá)。

圖1　WWOX在正常皮膚中的表達(dá)（SP，×400）

圖2　WWOX在交界痣中的表達(dá)（SP，×400）

圖3　WWOX在CMM中的表達(dá)（SP，×400）

圖4　P73在正常皮膚中的表達(dá)（SP，×400）

圖5　P73在交界痣中的表達(dá)（SP，×400）

圖6　P73在CMM中的表達(dá)（SP，×400）

表1　WWOX在三種組織中的表達(dá)

表2　P73在三種組織中的表達(dá)

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSSl7.0處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用卡方檢驗(yàn)比較WWOX、P73蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)探究其在CMM中的陽(yáng)性表達(dá)率與臨床病理特征之間的關(guān)系，并分析CMM組織中兩種蛋白表達(dá)的相關(guān)性，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意的P＜0.05，χ2分割檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P′=0.0167。

2　結(jié)果

2.1WWOX在CMM、交界痣及正常皮膚組織中的表達(dá)

棕黃色顆粒狀的WWOX主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi)。WWOX在CMM、交界痣到正常皮膚中的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，分別為15.15%（10/66）、46.67%（14/30）和85.00%（17/20），WWOX在三組中的表達(dá)水平有差異，并且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），三組間兩兩比較的結(jié)果顯示：WWOX蛋白在正常皮膚的表達(dá)水平明顯高于交界痣，其在交界痣的表達(dá)水平明顯高于CMM，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0167）。見表1，圖1～3。2.2 P73在CMM、皮膚交界痣及正常皮膚組織中的表達(dá)［5］

棕黃色顆粒的P73蛋白主要集中在胞核內(nèi)，P73蛋白在CMM、交界痣到正常皮膚的表達(dá)逐漸降低，分別為78.79%（52/66）、46.67%（14/30）、10%（2/20），P73蛋白在三組中的表達(dá)水平有差異，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），三組間兩兩比較的結(jié)果顯示：P73蛋白在正常皮膚的表達(dá)水平低于交界痣，其在交界痣的表達(dá)水平低于CMM（P＜0.0167）。見表2、圖4～6。

表3　WWOX在CMM組織中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

表4　P73在CMM組織中的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3WWOX、P73的表達(dá)與CMM病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3.1CMM組織中WWOX的表達(dá)水平隨腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)深度的增加而降低，同時(shí)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(dá)水平低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.3.2CMM組織中P73的表達(dá)水平隨腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)深度的增加而增高，同時(shí)伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(dá)水平高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，并且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.4CMM中WWOX與P73蛋白的表達(dá)關(guān)系

CMM組織中的WWOX和P73蛋白均表達(dá)陽(yáng)性的病例共5例，均陰性表達(dá)的9例；WWOX表達(dá)陰性的47例病例，P73均呈陽(yáng)性表達(dá)；P73表達(dá)陽(yáng)性的5例病例，WWOX均呈陰性表達(dá)。二者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.298，P=0.015）。見表5。

表5　CMM組織中WWOX和P73蛋白表達(dá)的關(guān)聯(lián)性

3　討論

3.1WWOX與CMM

WWOX基因是由Bednarek等在染色體脆性位點(diǎn)FRA16D（16C23.3-24.1）區(qū)域克隆出的一個(gè)的基因。9個(gè)外顯子存在于WWOX基因，其蛋白大小為46kDa。在結(jié)構(gòu)上，WWOX具有與YES等蛋白功能相似的WW結(jié)構(gòu)域，以與配體結(jié)合的方式介導(dǎo)蛋白一蛋白的相互作用，因?yàn)樵摻Y(jié)構(gòu)富含高保守的氨基酸殘基［6］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)棕黃色顆粒的WWOX主要集中在細(xì)胞漿，且WWOX在CMM、交界痣、正常皮膚中的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)：其在CMM中低表達(dá)，從CMM、皮膚交界痣到正常皮膚，WWOX蛋白的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，且WWOX在三組中的表達(dá)率不同，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；三組間兩兩比較結(jié)果還顯示:WWOX在交界痣的表達(dá)陽(yáng)性率明顯高于CMM，其在正常皮膚的表達(dá)陽(yáng)性率高于交界痣，并且差異均具有有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0167），這均與已知研究基本一致，可以推測(cè)WWOX在CMM中表達(dá)下調(diào)，與皮膚黑色素細(xì)胞惡變、CMM的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可以作為一個(gè)監(jiān)測(cè)CMM發(fā)生發(fā)展的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)：隨腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)深度的增加，WWOX的表達(dá)陽(yáng)性率降低，而且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的表達(dá)水平低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可以推測(cè)WWOX表達(dá)缺失促進(jìn)了CMM的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，可以作為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)。

3.2P73與CMM

P73是法國(guó)科學(xué)家Kaghad等在選取胰島素信號(hào)傳遞的介導(dǎo)因子時(shí)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)假陽(yáng)性cDNA克隆，編碼與P53蛋白顯著同源的蛋白，P73自從發(fā)現(xiàn)之日起一直被寄希望是抑癌基因。但近些年的大量研究表明P73扮演的并不是單純的抑癌基因角色，而在某些腫瘤中，其表現(xiàn)出的是癌基因的特性［7］。通常所說的P73是TAp73，Np73與TAp73異互為構(gòu)體蛋白，二者相比，TAp73具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，而Np73則沒有。TAp73與P53的功能相似，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)的抑癌基因的特性；而Np73促進(jìn)腫瘤發(fā)生，表現(xiàn)出癌基因的促癌作用。在本實(shí)驗(yàn)中，從CMM、皮膚交界痣到正常皮膚P73蛋白的表達(dá)逐漸降低，在CMM中表達(dá)最高，在正常皮膚中表達(dá)最低；隨浸潤(rùn)深度的增加，CMM中P73蛋白的表達(dá)水平而升高（P＜0.05）；和不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者相比，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達(dá)水平較高（P＜0.05），可推測(cè)P73高表達(dá)促進(jìn)了CMM的發(fā)生發(fā)展浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［8-9］。

3.3WWOX與P73蛋白在CMM中表達(dá)的相關(guān)性

研究表明：WWOX扮演抑癌基因角色時(shí)，WWOX不僅直接抑制癌基因的促癌作用，而且也能激活抑癌基因如P53的促凋亡作用；作為細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的傳感器，WWOX通過WW結(jié)構(gòu)域與富含PPxY的P73相結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（有足夠的WWOX）［10］。本實(shí)驗(yàn)中P73蛋白與WWOX在CMM中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），可推測(cè)CMM中表達(dá)減弱或缺失的WWOX通過WW結(jié)構(gòu)結(jié)合富含PPxY的P73相結(jié)合進(jìn)行細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，增強(qiáng)了高表達(dá)的扮演癌基因角色P73的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了CMM的發(fā)生［11］。隨著CMM的進(jìn)展，WWOX表達(dá)降低，WWOX參與的細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不再發(fā)揮作用（沒有足夠的WWOX），此時(shí)表現(xiàn)癌基因特性的P73促進(jìn)CMM的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

綜上所述，WWOX及P73參與了CMM的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測(cè)WWOX及P73可能有助于CMM的早期診斷、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)，并可能成為基因治療的新靶點(diǎn)。

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編輯/張惠娟

Expression of WWOX，MDM2 and P73 protein in cutaneous malignant melanoma

LIANG Yan，NlU Fu-you，F(xiàn)AN Hai-xia，ZHANG Zhi-qi
（Department of Plastic Surgery，The first Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou，450052，Henan，China）

Objective To study the expression and correlation of WWOX and P73 protein in cutaneous malignant melanoma.MethodsRetrospective method was used in the study.The expression level of WWOX and p73 was determined using immunohischemistry staining in 66 cases of cutaneous malignant melanoma，30 cases of junctional nevus and 20 cases of normal skin tissues.The results were analyzed using chi-squared test and Spearman rank correlation test.P＜0.05 is considered statistically significant.P=0.0167 used for chi-squared test.All statistical analyses were performed using SPSS17.0.Results The positive rate of WWOX protein in CMM is significantly lower than thatin junction nevus，and the positive rate in junction nevus is significantly lower than that in normal skin（P＜0.0167），with the depth of tumor infiltration increasing，the expression of WWOX in CMM has decreased（P＜0.05），the expression of WWOX in the tissue with lymph node metastasis is significantly lower than that without lymph node metastasis（P＜0.05）.The positive rate in normal skin was less lower than that in junction nevus，and the positive rate in junction nevus was less lower than that in CMM（P＜0.0167），with the depth of tumor infiltration increasing，the expression of P73 in CMM has increased（P＜0.05），the expression level of P73 in the tissue with lymph node metastasis is significantly higher than that without lymph node metastasis（P＜0.05）.Conclusion WWOX and P73 might play an important role in occurrence and development of CMM，The combined detection of WWOX and P73 might be helpful for early diagnosis of CMM，to provide reference for clinical treatment and supply a new way for gene therapy of CMM.

cutaneous malignant melanoma（CMM）；WW domain-containing oxidoreductase（WWOX）gene；P73

R739.5

A

1008-6455（2015）11-0047-05

牛扶幼，河南省，鄭州市，鄭大一附院整形外科教授，主任醫(yī)師；主要研究方向：皮膚癌；郵編：450052

2015-03-22

2015-05-14