武鳳蓮,朱東來,王嘉欣,湯云陽,王連英

A型肉毒毒素對增生性瘢痕中TGF-β1和cyclinD1基因表達(dá)影響的研究

武鳳蓮,朱東來,王嘉欣,湯云陽,王連英

(秦皇島市第一醫(yī)院燒傷整形外科河北秦皇島066000)

目的:探討A型肉毒毒素(BTXA)對增生性瘢痕組織成纖維細(xì)胞中TGF-β1和cyclinD1表達(dá)的影響.方法:組織塊法培養(yǎng)增生性瘢痕組織及正常皮膚組織的成纖維細(xì)胞,用不同濃度的BTXA作用于體外培養(yǎng)的人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞,檢測MTT值;利用RT-PCR分析用藥前后TGF-β1和cyclinD1mRNA表達(dá)的變化及其他們的相關(guān)性.結(jié)果:BTXA在體外能明顯抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖及TGF-β1和cyclinD1mRNA的表達(dá).結(jié)論:BTXA對增生性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用,其作用機(jī)制與BTXA能抑制TGF-β1和cyclinD1mRNA的表達(dá)有關(guān);同時在抑制成纖維細(xì)胞的過程中,TGF-β1和cyclinD1mRNA的表達(dá)并無相關(guān)性.

A型肉毒毒素;增生性瘢痕;TGF-β1;cyclinD1

目前治療增生性瘢痕的方法很多,包括壓迫法、放療法、激光與手術(shù)切除法、瘢痕內(nèi)藥物注射法等[1],但迄今沒有哪一種方法可以完全達(dá)到令人滿意的效果.而藥物注射治療病理性瘢痕因其操作簡單,費用低廉及效果明顯的特點而越來越易被患者接受,其中臨床常用的有曲安奈德、5-氟尿嘧啶、復(fù)方倍他米松注射液等.近來有研究用A型肉毒毒素(BTXA)治療瘢痕取得了較好的臨床治療效果[2-3].本研究通過對A型肉毒毒素注射治療增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞中的TGF-β1和cyclinD1基因表達(dá)的影響及其相關(guān)性,研究其注射治療增生性瘢痕的原理,為治療病理性瘢痕提供理論依據(jù).

1　材料和方法

1.1材料

標(biāo)本取自本科室瘢痕患者手術(shù)切下的增生性瘢痕組織及正常的皮膚組織,患者年齡14歲～45歲,平均年齡32歲;病程4個月～2年,患者3個月內(nèi)均未經(jīng)過免疫治療,放射線治療及激光治療,取標(biāo)本前均得到患者的知情同意.

1.2儀器與試劑

DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司USA),BTXA(蘭州生物制品研究所),Trizol總RNA提取試劑盒,Promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,taq酶購于日本TAKARA;MTT、DMS0購于SIGMA USA,新生小牛血清,光學(xué)顯微鏡,PCR儀器. 1.3成纖維細(xì)胞培養(yǎng)

將手術(shù)切下的增生性瘢痕組織及正常的皮膚組織用含100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的PBS緩沖液反復(fù)沖洗三次后將其剪成1mmX1mm大小的小組織塊,接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)方瓶中,在37.0℃,5%(體積分?jǐn)?shù))的C02、95%空氣及飽和濕度的孵箱中靜置培養(yǎng),根據(jù)細(xì)胞的生長情況,每周更換兩到三次培養(yǎng)液,待3周后原代細(xì)胞從組織塊中長出并爬滿培養(yǎng)瓶底后進(jìn)行傳代,采用0.25%胰蛋白酶及0.02%乙二胺四乙酸消化,按1∶4傳代,藥物實驗所用細(xì)胞為4代.

1.4MTT比色法

將第四代對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞制成5X106懸浮液,以每孔100μl的成纖維細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中.置于孵箱中繼續(xù)孵育24h.待細(xì)胞完全貼壁后去除培養(yǎng)液,分別加入含濃度(U/ml)0.1, 0.2,0.4,0.8,1.6 BTXA的10%小牛血清的DMEM 200μl,培養(yǎng)液每組設(shè)6個平行孔及空白對照孔,加藥后放進(jìn)孵箱中繼續(xù)孵育48h.然后每孔加MTT(5mg/ ml)20μl繼續(xù)孵育3h后,棄掉上清液,每孔加200μl DMS0振蕩混勻,用自動酶聯(lián)免疫分析儀在設(shè)定波長492nm時測定其0D值.計算藥物的抑制率(IR):

IR=(1-實驗組0D值/對照組0D值)X100%

1.5TGF-β1和cyclinD1mRNA表達(dá)的檢測

將濃度為0.4U/ml的BTXA加入含有1X106個/ml第4代細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中,放入孵箱中孵育48h,收集細(xì)胞.用TRizol試劑提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA.然后采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reation,RTPCR)進(jìn)行擴(kuò)增.RT-PCR反應(yīng)體系為20μl,構(gòu)成如下:10Xbuffer 2.5μl,dNTP 2μl,Taq酶2.5U,模板4μg,β-actin上下游引物及各特異性引物上下游各1μl,加水至總反應(yīng)體積20μl.擴(kuò)增條件: 94℃預(yù)變性5min,94℃變性30S,退火溫度見下表, 72℃延伸1min,32個循環(huán),最后72℃再延伸8min終止反應(yīng).引物設(shè)計見表1.

1.6PCR產(chǎn)物分析

取8μl PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳分析,用凝膠掃描成像分析儀處理系統(tǒng)掃描各條帶紫外光吸收量(Vol).目的基因Vol值與相應(yīng)內(nèi)參βactin Vol值的比值代表每個樣本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物mRNA的相對表達(dá)量,測定并比較增生性瘢痕與正常皮膚,以及加入肉毒毒素作用后增生性瘢痕TGF-β1及cyclinD1基因的表達(dá)的變化.

1.7統(tǒng)計學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1顯微鏡下成纖維細(xì)胞形態(tài)變化

增生性瘢痕成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng),可見小組織塊邊緣有梭形的細(xì)胞爬出,逐漸布滿培養(yǎng)瓶底部,培養(yǎng)液中加入不同濃度的BTXA孵育48h,鏡下可見隨著BTXA濃度的增加,成纖維細(xì)胞凋亡的數(shù)量越多(圖1～4).

2.2觀察BTXA對成纖維細(xì)胞增殖的影響

正常皮膚和增生性瘢痕成纖維細(xì)胞加入不同濃度的A型肉毒毒素,A型肉毒毒素作用于成纖維細(xì)胞48h后,用MTT法檢測細(xì)胞增殖的變化.結(jié)果顯示,同一觀察時間,隨著BTXA濃度的增大,其對成纖維細(xì)胞的抑制率顯著增高,見表2.

表1　用primer5.0輔助設(shè)計引物

表2　不同濃度BTXA對兩組細(xì)胞的抑制率(±s,n=6)

表2　不同濃度BTXA對兩組細(xì)胞的抑制率(±s,n=6)

注:對照組與各濃度組比較P<0.001

BTXA濃度(U/ml)抑制率(%)正常皮膚增生性瘢痕0(對照)00 0.15.91±0.01857.94±0.0156 0.215.51±0.02518.93±0.0102 0.432.16±0.04645.35±0.0287 0.853.67±0.04250.05±0.0231 1.680.01±0.01283.48±0.0257

表3　各組細(xì)胞周期因子的表達(dá)

2.3各組成纖維細(xì)胞中TGF-β1及cyclinD1mRNA表達(dá)的測定

各組用RT-PCR電泳凝膠條帶的Vol值與相對應(yīng)的β-actin基因Vol值得比值作為各組樣本TGF-β1及cyclinD1mRNA的相對表達(dá)量,增生性瘢痕組中成纖維細(xì)胞的TGF-β1及cyclinD1mRNA的表達(dá)量明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞組,其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).增生性瘢痕組成纖維細(xì)胞加入濃度為0.4U/ml的BTXA的培養(yǎng)液培養(yǎng)48h,與未加藥前比較,TGF-β1及cyclinD1的表達(dá)量明顯下降,有顯著性意義(P<0.01)(表3).各組樣本PCR電泳結(jié)果表明增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中的TGF-β1及cyclinD1基因的表達(dá)明顯高于正常皮膚組;加藥物處理組中的TGF-β1、cyclinD1基因表達(dá)明顯低于未加藥前的(圖5、6).

3　討論

增生性瘢痕是病理性瘢痕的一種,由于其具有增生及攣縮的特性,常會給患者造成器官的畸形及功能的障礙,增生瘢痕發(fā)生的原理、預(yù)防及治療一直是整形外科的難題.增生性瘢痕的細(xì)胞成分主要包括成纖維細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等[4].其中成纖維細(xì)胞在增生性瘢痕形成機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,在組織學(xué)上,增生性瘢痕主要是因成纖維細(xì)胞的過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積而形成的,細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是大量的膠原纖維.在增生性瘢痕中成纖維細(xì)胞因為缺乏凋亡或者凋亡機(jī)制不能夠進(jìn)入正常的程序死亡[5]而導(dǎo)致其過度增殖,使細(xì)胞外基質(zhì)過度聚集[6].同時其中的成肌纖維細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的的特點和功能作用,在傷口瘢痕愈合的過程中也發(fā)揮著重要作用,其在增生性瘢痕形成時大量增生,并可與成纖維細(xì)胞之間互相轉(zhuǎn)化及互相影響,在功能上,兩者相互協(xié)調(diào)進(jìn)行膠原蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)和膠原的合成,共同參與瘢痕的形成.在分子生物學(xué)上,增生性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展是由多種細(xì)胞及細(xì)胞周期相關(guān)因子異常調(diào)控有關(guān)[7].轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β1在修復(fù)創(chuàng)面中扮演重要角色,可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和分泌細(xì)胞外基質(zhì),又可抑制其降解.同時TGF-β1能夠誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞,同時又兼具促進(jìn)成肌細(xì)胞異常聚集的特點[8-9]. TGF-β1是一種有很強(qiáng)趨化能力的因子,是巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的有力刺激劑,經(jīng)自分泌及旁分泌使TGF-β1的局部濃度升高,激活巨噬細(xì)胞,同時刺激幼稚細(xì)胞增殖,從而進(jìn)一步促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖及成肌細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量的增加[10].有研究報道加入外源性的TGF-β1,其也可以增加創(chuàng)面中的膠原纖維、和炎性細(xì)胞的數(shù)量,促進(jìn)瘢痕愈合[11].總之, TGF-β1在組織損傷的修復(fù)及組織再生的各個階段中發(fā)揮著重要作用,包括炎性反應(yīng)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[12].CyclinD1基因位于染色體11q13,全長15kb,含5個外顯子.CyclinD1是G1期細(xì)胞增殖信號的關(guān)鍵蛋白,在增生瘢痕中,其表達(dá)均明顯高于正常皮膚的表達(dá).CyclinD1蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶CDK4/CDK6結(jié)合形成復(fù)合物,使Rb發(fā)生磷酸化而與E2F分離,釋放的E2F發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的效應(yīng),促進(jìn)細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞增殖.而當(dāng)CyclinD1或CDK4/CDK6表達(dá)失控時,超過了細(xì)胞限制點,就會導(dǎo)致細(xì)胞的增殖異常[13].有研究表明:細(xì)胞周期蛋白與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶可作為TGF-β1的負(fù)性調(diào)節(jié)的靶蛋白,經(jīng)TGF-β1調(diào)解可以使CyclinD1及CDK4顯著降低,使細(xì)胞增殖停滯在G1期.同時TGF-β1分泌的增加及作用,通過抑制CyclinD1蛋白的表達(dá)而抑制細(xì)胞進(jìn)入S期,使細(xì)胞停滯在G1期[14].

圖1　增生性瘢痕組織塊周圍可見成纖維細(xì)胞爬出

圖2　細(xì)胞布滿培養(yǎng)瓶底

圖3　加入BTXA 0.2U 48h后成纖維細(xì)胞

圖4　加入BTXA 1.6U 48h后成纖維細(xì)胞

圖5　TGF-β1與β-actin電泳

圖6　cyclinD1與β-actin電泳

BTXA在當(dāng)代已廣泛應(yīng)用于美容整形外科領(lǐng)域,由于其微創(chuàng)、安全、效果明顯,不用住院,不影響求美者的正常工作及生活而備受青昧.目前主要用其治療面部皺紋,如額紋、眉間紋、鼻間紋及魚尾紋.有研究發(fā)現(xiàn)BTXA能夠抑制前列腺增生,同時促使鼻黏膜細(xì)胞凋亡,為我們用BTXA注射治療增生性瘢痕提供理論依據(jù).近年來也有文獻(xiàn)報道,BTXA治療增生性瘢痕及瘢痕疙瘩取得了較理想的臨床效果[15-16],其作用原理可能是抑制瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞的過度增殖及減少膠原纖維的沉積[3,17];同時還能夠抑制成纖維細(xì)內(nèi)的TGF-β1因子[18].本實驗發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕組與正常皮膚組成纖維細(xì)胞中的TGF-β 1及CyclinD1mRNA的表達(dá)相比較,增生性瘢痕組均高于正常皮膚組.由此推測TGF-β1及CyclinD1mRNA的異常表達(dá)是形成增生性瘢痕的重要因素;BTXA作用于增生性瘢痕及正常皮膚組的成纖維細(xì)胞后,通過MTT比色法證明BTXA能明顯抑制體外的成纖維細(xì)胞生長(P<0.01),隨著BTXA濃度的增加,對成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用越明顯.選擇濃度為0.4μ/ml的BTXA做用于增生性成纖維細(xì)胞48h后,RT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1及CyclinD1mRNA的表達(dá)明顯低于未用藥的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞(P<0.05).此實驗結(jié)果提示BTXA治療增生性瘢痕的機(jī)制可能通過抑制TGF-β1及CyclinD1mRNA的表達(dá)抑制細(xì)胞進(jìn)入S期,是成纖維細(xì)胞停滯在G1期,從而導(dǎo)致成纖維細(xì)胞增殖受到抑制并減少細(xì)胞外基質(zhì)的分泌聚集.然而,在本實驗中,增生性瘢痕組中TGF-β1及CyclinD1mRNA的表達(dá)都明顯升高,用藥組的增生性瘢痕組中TGF-β1及CyclinD1mRNA的表達(dá)又明顯降低,CyclinD1mRNA的表達(dá)并未受到TGF-β1的負(fù)向調(diào)控.說明BTXA在抑制增生性瘢痕成纖維細(xì)胞增殖的過程中TGF-β1及CyclinD1并無明顯相關(guān)性.本實驗雖在BTXA治療及預(yù)防增生性瘢痕提供了實驗基礎(chǔ),但對其具體機(jī)制尚需大量實驗研究理論支持,以及對其他參與細(xì)胞周期調(diào)控因子的影響也有待于進(jìn)一步的實驗研究.

[1]蔡景龍.瘢痕的治療方法評價及展望[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2013,93(14):1041-1043.

[2]顏彤彤,陳敏亮,馬奎,等.A型肉毒毒素治療攣縮性瘢痕[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2013.19(13):196-199.

[3]于波,陳敏亮,劉文閣,等.A型肉毒毒素預(yù)防和治療增生性瘢痕的臨床初探[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志,2008,14(2): 98-100.

[4]汪良能,高學(xué)書.整形外科[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996: 318-324.

[5]Igarashi A.Regulation of connective tissue growth factor gene expression in human skin fibroblast and during woung repair[J].Mol Biol Sci,1993,4:637-681.

[6]吳包金,吳建明,林子豪,等.增生性瘢痕退行性變過程中的細(xì)胞凋亡和相關(guān)基因表達(dá)[J].中華燒傷雜志,2006,22(6): 469-470.

[7]張娟娟,呂世軍.病理性瘢痕發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2007,13(8):580-582.

[8]Thorey IS,Hinz B,Hoeflich A,et al.Trasgenic mice revcal novelactivitiesofgrowthhormoneinwoundrepair, angiogenesisandmyofibroblastdifferentiation[J].JBiol Chem,2004,279(25):26674-26684.

[9]Spyrou GE,Naylor IL.The effect of basic fibroblasts growth factor on scarring[J].Br J Plast Surg,2002,55(4):275-282.

[10]Brandes ME,Mai UE,Ohura K,et al,Type I transforming growthfacror-βreceptorsonneutrophilsmediate chemotaxis to transforming growth factor-β[J].J Immunol, 1991,147(5):1600-1606.

[11]Campaner AB,Ferreira LM.Gragnani A,et al.Upregulation of TGF-betal expression may be necessary but is not sufficient for excessive scarfing[J].J Invest Dermatol,2006, 126(5):1168-1176.

[12]Bottinger EP,Bitzerm.TGF-β1 signaling in renal disease[J]. JAm Soc Nephrol,2002,13(3):2600-2610.

[13]LangeC,HuttnerWB,CalegariF.Cdk4/CyclinD1 Overexpression in Neural Stem Cells Shortens G1,Delays Neurogenesis,andPromotestheGenerationand Expansiong of Basal Progenitors[J].Cell Stem Cell,2009,5 (3):320-331.

[14]余芳,張端蓮,陜聲國,等.人皮膚血管瘤組織中TGF-β1、CyclinD1的表達(dá)及相關(guān)性分析[J].武漢大學(xué)學(xué)報,2005,26 (3):280-285.

[15]ZhiboX,MiaoboZ.Potentialtherapeuticeffectsof botulinum toxin type A in keloid management[J].Med Hypotheses,2008:71(4):623-625.

[16]Uyesugi B,Lippincott B,Dave S.Treatment of a painful keloid with botulinum toix type A[J].Am J Phya Med Rehabil,2010:89(2):153-155.

[17]Xiao Z,Qu G.Effects of botulinum toxin type on collagen deposition in hypertrophic scars[J].Molecules,2012,17(2): 2169-2170.

[18]Xiao Z,Zhang M,Liu Y,et al.Botulinum toxin type A inhibits connevtive tissue growth factor expressiong in fibroblasts derived from hypertrophic scar[J].Aesther Plast Surg,2011,35(5):802-807.

編輯/張惠娟

Study on BTXA on the expression of TGF-β1 and cyclinD1 in hypertrophic scar

WU Feng-lian,ZHU Dong-lai,WANG Jia-xin,TANG Yun-yang,WANG Lian-ying
(Department of Burn and Plastic Surgery,The First Hospital of Qinhuangdao,Qinhuangdao 066000, Hebei,China)

Objective To investigate the effect of botulinum toxin A(BTXA)on the expression of TGF-β 1 and cyclinD1 of hypertrophic scar fibroblast.Methods After treated with different concertrations of BTXA,inhibition rate.The expression and correlation of TGF-β1 of cyclinD1of hypertrophic scar fibroblasts were detected by MTT assay and RT-PCR respectively.Results BTXA can significantly inhibit the proliferation of hypertrophic scar fibroblast,and the expression of TGF-β1 and cyclinD1could be inhibited significantly.ConclusionThe mechanism of BTXA on inhibiting fibroblast of hypertrophic scar may be related with regulation of the expression of TGF-β1 of cyclinD1,and there was no correlation between the expression of TGF-1 and cyclinD1mRNA on inhibiting fibroblast of hypertrophic scar.

botulinum toxin A(BTXA);hypertrophic scar;TGF-β1;cyclinD1

R619+.6

A

1008-6455(2015)06-0037-05

王連英,主任醫(yī)師,河北省秦皇島市,秦皇島市第一醫(yī)院燒傷整形外科,066000

2014-12-21

2015-03-04