朱靜,張汝芝,程賽,,金慧玲

皮膚組織塊培養(yǎng)獲取原代細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)觀察

朱靜1,張汝芝2,程賽1,2,金慧玲1

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院皮膚性病科安徽蚌埠233004;2.蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科江蘇常州213003)

目的:從皮膚組織塊培養(yǎng)獲取原代細(xì)胞.方法:將皮膚組織塊修剪成2mmX2mm大小,放置到培養(yǎng)皿中,真皮層向下,觀察細(xì)胞爬出的情況.結(jié)果:組織塊培養(yǎng)第3天,有角質(zhì)形成細(xì)胞從組織塊爬出,第7天左右組織塊周圍出現(xiàn)黑素細(xì)胞,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),組織塊周圍出現(xiàn)大量成纖維細(xì)胞.結(jié)論:在組織塊培養(yǎng)過(guò)程中,早期可以收集較純的角質(zhì)形成細(xì)胞,含血清的DMEM培養(yǎng)20d后,可以得到大量成纖維細(xì)胞.

組織塊培養(yǎng);原代細(xì)胞;前體細(xì)胞

皮膚原代細(xì)胞的獲得與培養(yǎng)對(duì)于基礎(chǔ)和臨床研究有著重要的意義.然而,通過(guò)中性蛋白酶和胰酶消化將表皮細(xì)胞游離,然后進(jìn)行細(xì)胞的貼壁培養(yǎng),繼而經(jīng)差別胰酶消化將細(xì)胞純化,得到的角質(zhì)形成細(xì)胞容易受到成纖維細(xì)胞的污染.在本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)皮膚組織塊的培養(yǎng)方法,通過(guò)不同細(xì)胞從組織塊爬出的時(shí)間不同,探索獲得原代細(xì)胞的方法.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1包皮:包皮環(huán)切術(shù)中的包皮組織(提供者為18歲健康男性)

1.1.2試劑:中性蛋白酶(sigma),0.05%及0.25%的胰酶/0.53mmol/L EDTA(吉諾生物公司),人黑素細(xì)胞培養(yǎng)基(Medium 254)及黑素細(xì)胞生長(zhǎng)添加成分( human melanocyte growth supplement,HMGS)(包含5μg/ml胰島素,50μg/ml維生素C,6mmol/L L-谷氨酰胺,0.20mmol/L氯化鈣等),人表皮細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基,角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)添加成分(human keratinocytegrowthsupplement,HKGS) (0.18μg/ml氫化可的松、0.20ng/ml EGF、5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、5μg/ml胰島素和8μg/ml霍亂毒素)(美國(guó)Invitrogen公司),胎牛血清(四季青)(浙江天航生物科技有限公司),兔抗人Vimentin單克隆抗體(福州邁新生物科技有限公司),GTVisionTMⅢ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒(上?；蚩萍加邢薰?.

1.2方法

1.2.1組織塊培養(yǎng):碘伏浸泡包皮標(biāo)本10min,磷酸鹽緩沖液(PBS,含400 U/ml青霉素和400U/ml鏈霉素)將碘伏沖洗干凈,修剪皮下組織,在接近表真皮交界處,將皮膚組織塊剪成約2mmX2mm大小,放置到培養(yǎng)皿中,真皮層向下.將含有20%胎牛血清的DMEM少量分別滴加到組織塊表面,液體量剛好將組織塊浸潤(rùn),置入37℃孵箱中.第2天,待組織塊貼緊培養(yǎng)皿底壁后,添加的液體換成含HKGS的表皮細(xì)胞培養(yǎng)基(不含血清).每天適當(dāng)添加培養(yǎng)基,使得組織塊不會(huì)因液體少而干,而不會(huì)因液體多而漂浮,分別觀察組織塊的變化.

1.2.2細(xì)胞爬片:組織塊培養(yǎng)20d后,將殘余的組織塊挑除,胰酶消化貼壁的細(xì)胞,中和后獲得單細(xì)胞懸液,重新種植并進(jìn)行部分細(xì)胞爬片.爬片3d后,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色.

1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)染色:PBS潤(rùn)洗細(xì)胞爬片,4%多聚甲醛固定10min,PBS沖洗,0.1%的triton-100溶液細(xì)胞通透10min,PBS沖洗,20%的胎牛血清室溫下封閉20～30min,PBS沖洗,加一抗Vimentin抗體(1:50稀釋),4℃過(guò)夜,復(fù)溫30min,PBS沖洗,含HRP的通用型二抗孵育30min,PBS沖洗,DAB顯色液顯色,顯微鏡下觀察,終止,攝片.

圖1　組織塊培養(yǎng)第5天,角質(zhì)形成細(xì)胞爬行到組織塊周圍

圖2　第7天有樹(shù)突狀細(xì)胞從角質(zhì)形成細(xì)胞的間隙爬出

圖3　樹(shù)突狀細(xì)胞成簇爬出

圖4　樹(shù)突狀細(xì)胞成團(tuán)分布

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞生長(zhǎng)情況

培養(yǎng)皿中組織塊培養(yǎng)第3天開(kāi)始,有角質(zhì)形成細(xì)胞爬出,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞爬行到離組織塊的距離越遠(yuǎn)(見(jiàn)圖1).培養(yǎng)7d左右,有樹(shù)突狀細(xì)胞爬出,樹(shù)突狀細(xì)胞在角質(zhì)形成細(xì)胞間隙中爬行,甚至游離到超出角質(zhì)形成細(xì)胞的范圍(見(jiàn)圖2),可以推斷為黑素細(xì)胞.部分樹(shù)突狀細(xì)胞呈簇狀從組織塊周圍爬出,細(xì)胞多呈現(xiàn)雙樹(shù)突,棒槌樣(見(jiàn)圖3),穿過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞,部分呈細(xì)胞成團(tuán)樣分布(見(jiàn)圖4).

2.2組織塊培養(yǎng)20d后

隨著含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)組織塊時(shí)間的延長(zhǎng),逐漸出現(xiàn)細(xì)胞網(wǎng)狀生長(zhǎng),培養(yǎng)20d后,大量梭形細(xì)胞,形態(tài)難以區(qū)別是黑素細(xì)胞還是成纖維細(xì)胞(見(jiàn)圖5).胰酶消化獲得單細(xì)胞懸液貼壁生長(zhǎng)后進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,結(jié)果示:細(xì)胞呈不規(guī)則網(wǎng)狀分布,波形蛋白抗體染色陽(yáng)性(見(jiàn)圖6),可以表明細(xì)胞均為成纖維細(xì)胞.

圖5　組織塊培養(yǎng)20d后,大量梭形細(xì)胞

圖6　波形蛋白染色陽(yáng)性

3　討論

在本實(shí)驗(yàn)中,皮膚組織塊培養(yǎng)第3天左右,角質(zhì)形成細(xì)胞從組織塊周圍爬出,無(wú)其他細(xì)胞混雜,此時(shí)胰酶消化可以得到較為純凈的角質(zhì)形成細(xì)胞,不受成纖維細(xì)胞污染.這種皮膚組織塊培養(yǎng)法可以獲取原代角質(zhì)形成細(xì)胞,用于大面積燒傷的治療[1].獲取人原代角質(zhì)形成細(xì)胞的方法有兩種,Medawar等人提出的中性蛋白酶將表真皮層分離然后游離表皮細(xì)胞[2],或者是組織塊培養(yǎng)獲得[3].前種方法能較快獲取細(xì)胞懸液,貼壁培養(yǎng)后再進(jìn)行純化,然而純化得到的角質(zhì)形成細(xì)胞仍然容易受到成纖維細(xì)胞的污染.而且有實(shí)驗(yàn)者通過(guò)比較兩種方法獲取髕韌帶細(xì)胞后比較細(xì)胞生長(zhǎng)差異很大[4].

在本實(shí)驗(yàn)中,組織塊開(kāi)始有角質(zhì)形成細(xì)胞爬出,但是經(jīng)過(guò)含血清的培養(yǎng)基,具有篩選作用,從而獲得大量成纖維細(xì)胞,而獲取成纖維細(xì)胞,可以用來(lái)研究疾病,也可以作為重編程產(chǎn)生多潛能細(xì)胞的來(lái)源[5].

組織塊培養(yǎng)第7～10天,有樹(shù)突狀細(xì)胞爬出,部分成細(xì)胞團(tuán)樣生長(zhǎng),且能移行到組織塊周圍,可以推斷細(xì)胞增殖、遷移能力很強(qiáng),具有細(xì)胞前體的一定特點(diǎn).Aihua Guo等人通過(guò)組織塊培養(yǎng)獲得的角質(zhì)形成細(xì)胞具有表達(dá)K5、K6等細(xì)胞前體的標(biāo)記物,證實(shí)了其具有細(xì)胞前體的特點(diǎn)[6].組織塊培養(yǎng)法獲得大鼠視網(wǎng)膜干細(xì)胞[7],用于擴(kuò)增人脂肪源性干細(xì)胞[8],分離獲得皮膚和肺組織的間質(zhì)細(xì)胞前體[9],用于分離毛囊bulge區(qū)細(xì)胞[10]等這些實(shí)驗(yàn)表明組織塊培養(yǎng)法將會(huì)是獲得細(xì)胞前體較為簡(jiǎn)單方法,更有利于觀察這些細(xì)胞前體的生物學(xué)特征.

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編輯/張惠娟

The observation of skin explants culture to harvest primary cell

ZHU Jing1,ZHANG Ru-zhi2,CHENG Sai1,2,JIN Hui-ling1
(1.Department of Dermatology,The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College,Bengbu 233004,Anhui,China;2.Department of Dermatology,The Third Affiliated Hospital of Suzhou University, Changzhou 213003,Jiangsu,China)

Objective To harvest primary cells from skin explants culture.Methods Skin explants in size of 2mmX2mm were obtained by using sharp scissors,each skin explant placed onto the bottom of culture dish,and they were oriented with the epidermis facing up,then observe the cells migrating from the explants.ResultsFrom the third day,keratinocytes migrating from the explants,then melanocytes appear around the explants.As culture time getting longger,a large number of fibrolasts around the explant.Conclusion During the explant culture,we could harvest keratinocyte without contamination firstly,and DMEM contain serum culture for 20days,could harvest a large number of fibrolasts.

explants culture;primary cell;cell progenitors

Q813.1

A

1008-6455(2015)06-0034-03

國(guó)家自然科學(xué)基金課題(項(xiàng)目編號(hào):81171516)

張汝芝,主任醫(yī)師,蘇州大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科,江蘇常州,郵編:213003,E-mail:zhangruzhi628@163.com

2015-01-10

2015-02-03