韓雪,梁文艷,梁文麗,張?jiān)?孫樂(lè)棟

.基礎(chǔ)研究.

大氣細(xì)顆粒物對(duì)小鼠皮膚組織中表皮生長(zhǎng)因子受體mRNA表達(dá)的影響

韓雪1,梁文艷2,梁文麗1,張?jiān)?,孫樂(lè)棟1

(1.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院廣東廣州510280;2.北京林業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院北京100083)

目的:研究大氣細(xì)顆粒物對(duì)小鼠皮膚組織表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)mRNA表達(dá)的影響,以探討大氣細(xì)顆粒物對(duì)皮膚老化的影響.方法:將40只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組及大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)染毒低、中、高劑量(分別為1.6、8.0和40.0mg/kg)組,每組10只.各劑量組均經(jīng)氣管滴注染毒3d.末次染毒24h后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分別檢測(cè)各組小鼠皮膚組織EGFRmRNA的表達(dá)量.結(jié)果:與對(duì)照組相比,PM2.5染毒中、高劑量組EGFRmRNA的表達(dá)量均明顯升高(P<0.05),且與劑量呈正相關(guān).結(jié)論:中、高濃度PM2.5可以誘導(dǎo)EGFRmRNA的表達(dá),促進(jìn)皮膚老化的發(fā)生.

大氣細(xì)顆粒物;表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體;實(shí)時(shí)熒光定量PCR

皮膚衰老是隨著增齡而出現(xiàn)的皮膚生理結(jié)構(gòu)紊亂及功能退化的復(fù)雜過(guò)程,其同時(shí)受到內(nèi)在因素和外在因素的綜合影響,一般表現(xiàn)為自然衰老和光老化兩種形式[1].自然衰老主要受遺傳等內(nèi)源性因素影響,隨時(shí)間流逝而逐漸顯現(xiàn),多表現(xiàn)在皺紋細(xì)淺,皮膚干燥、松弛和粗糙[2].皮膚覆蓋體表,是人體與外界交流聯(lián)系的最重要窗口,在衰老時(shí)極易暴露,直接引起焦慮、抑郁、自卑等一系列的心理和社會(huì)問(wèn)題,對(duì)人們的生活、工作帶來(lái)嚴(yán)重影響.因此,預(yù)防和延緩皮膚衰老成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一[3].

表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)在皮膚老化的形成中是一個(gè)早期事件,在皮膚老化的過(guò)程中處于關(guān)鍵性的作用[4].空氣顆粒物污染和皮膚老化之間的關(guān)系是環(huán)境流行病學(xué)研究的熱點(diǎn)之一,但具體機(jī)制尚未明了.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究大氣細(xì)顆粒物對(duì)小鼠皮膚組織EGFR mRNA表達(dá)的影響,探討其可能的影響機(jī)制.

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:BALB/c雌性小鼠40只(由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),體重18～20g.

1.1.2主要儀器和試劑:主要試劑包括:QIAEⅡAgarose Gel Extraction Protocal(德國(guó)Qiagen公司產(chǎn)品)RNA提取試劑,RT-PCR試劑,逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen公司產(chǎn)品)等.主要儀器包括Thenmo Anderson G-2.5大流量采樣器(美國(guó)熱電公司)、紫外分光光度計(jì)(美國(guó)bio-Rad公司)、Stratagene Mx3000P Real time PCR儀(美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品)等.

1.1.3引物序列:利用TRIZ0L提取基因組,設(shè)計(jì)并合成EGFR引物:上游引物:5'-AGCTCACGCAGTTGGGCA-3'.下游引物:5'-TCTCATGGGCAGCTCCTT-3'.

1.2方法

1.2.1PM2.5來(lái)源和處理:在廣州市海珠區(qū)某建筑物樓頂(周圍無(wú)明顯污染源,高12.2m)使用Thenmo Anderson G-2.5大流量采樣器采集2014年8月-9月的大氣PM2.5.將采有PM2.5的濾膜剪成1cm2大小,用三蒸水浸泡,超聲振蕩30min后,用六層紗布過(guò)濾PM2.5震蕩液,連續(xù)浸泡、震蕩、過(guò)濾3次,真空冷凍干燥濾液成干粉,保存4℃冰箱中備用.臨用前稱取一定量PM2.5干粉,在超凈臺(tái)中加入DMEM培養(yǎng)溶液(Gibco公司)超聲震蕩15min混勻并滅菌,配制成不同濃度的PM2.5溶液備用.

1.2.2動(dòng)物分組及染毒:將40只BALB/c雌性小鼠隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組及大氣細(xì)顆粒物(PM2.5)染毒低、中、高劑量(分別為1.6、8.0和40.0mg/kg)組,每組10只.各劑量組均經(jīng)氣管滴注染毒,滴注體積為1.5ml/kg,連續(xù)染毒3d,每次間隔24h.

1.2.3皮膚組織RNA的提取:用Trizol法,按照說(shuō)明書從各組小鼠背部皮膚組織中常規(guī)提取RNA,-80℃凍存?zhèn)溆? 1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè):逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以2μg總RNA為模板,按照PrimeScript?1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)說(shuō)明書配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,總體系為20μl,合成cDNA.熒光定量RT-PCR的條件優(yōu)化:對(duì)Mg2+、引物等濃度進(jìn)行優(yōu)化.

Real time PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25μl (TAKARA SYB?Premix Ex Taq kit)按照:95℃30s,95℃5s,60℃30s,40循環(huán),用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn).

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

分別做Wilcoxon秩和檢驗(yàn),SPSS17.0軟件分析,結(jié)果中數(shù)據(jù)以"median(P25～P75)"表示, P<0.05時(shí)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2　結(jié)果

2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

皮膚組織中PM2.5染毒中、高劑量EGFR mRNA的表達(dá)量均高于對(duì)照組,且與劑量呈正相關(guān),見(jiàn)表1和圖1.

表1　皮膚組織中EGFR mRNA的表達(dá)水平

圖1　大氣細(xì)顆粒物濃度與EGFR mRNA表達(dá)的相關(guān)性分析表

2.2不同濃度PM2.5與EGFR mRNA的表達(dá)量的相關(guān)性分析

不同濃度PM2.5與皮膚組織EGFR mRNA的表達(dá)量存在正相關(guān)(Kendall's tau_b:r=0.784,P=0.000; Spearman's rho:r=0.903,P=0.000),r>0.40,兩者相關(guān)性顯著.

3　討論

研究發(fā)現(xiàn),EGFR的高表達(dá)與人體皮膚老化的關(guān)系密切.其不僅是皮膚老化過(guò)程中的一個(gè)早期事件,也可以作為一種判斷皮膚老化的早期指標(biāo)[4-5], Xu等[6]最新研究顯示,中波紫外線照射永生化角質(zhì)形成細(xì)胞,能夠使得c-jun,c-fos表達(dá)增高,而照射給予EGFR拮抗劑,這種趨勢(shì)被顯著減輕.這充分提示EGFR在皮膚老化中起重要作用.

大氣中粒徑小于或等于2.5μm,即PM2.5的顆粒物,稱為細(xì)顆粒物,又稱細(xì)粒、細(xì)顆粒.大量研究表明,PM2.5含有大量的有毒、有害物質(zhì)且在大氣中的停留時(shí)間長(zhǎng)、輸送距離遠(yuǎn),不僅對(duì)人體健康和大氣環(huán)境質(zhì)量有影響,更對(duì)人體的皮膚有影響,這些物質(zhì)依附在皮膚上,導(dǎo)致皮膚的代謝循環(huán)受到影響,引起黑頭、毛孔粗大、角質(zhì)堆積、皮膚老化等現(xiàn)象.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:PM2.5染毒低濃度劑量組EGFR mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而暴露于中、高濃度PM2.5環(huán)境下的小鼠皮膚出現(xiàn)老化現(xiàn)象,且中、高濃度PM2.5可以誘導(dǎo)EGFR mRNA的表達(dá),并與劑量呈正相關(guān).這可能是因?yàn)槠つw組織對(duì)一定濃度內(nèi)的PM2.5有防御功能,但超過(guò)一定濃度后,皮膚組織的防御功能破壞,導(dǎo)致EGFR mMRA高表達(dá).因此阻斷EGFR,有可能消除或極大減弱PM2.5引起的皮膚老化.

[1]Fisher GJ,Kang S,Varani J,et al.Mechanisms of photoaging and chronological skin aging[J].Arch Dermatol,2002,138 (11):1462-1470.

[2]郭麗紅,吳景東,魏錦富.黃芪對(duì)D-半乳糖致小鼠衰老模型作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2012,21(12):2313-2314.

[3]Knezevic D,Zhang W,Rochette PJ,et al.Bcl-2 is the targer of a UV-inducible apoptosis switch and a node for UV signaling [J].Proc NatlAcad Sci,2007,104(27):11286-11291.

[4]Hachiya A,Sriwiriyanont P,Fujimura T,et al.Mechanistic effectsoflong-termultravioletBirradiationinduce epidermal and dermal changes in human skin xenografts[J]. Am J Pathol,2009;174(2):401-413.

[5]Sakurada A,TsaoMS.PredictivebiomarkersforEGFR therapy[J].Drugs,2009,12(1):34-38.

[6]XuY,Voorhees JJ,Fisher GJ.Epidermal growth factor receptor isacriticalmediatorofultravioletBirradiation-inducedsignal transduction in immortalized human keratinocyte HaCaTcells [J].AmJPathol,2006,169(3):823-830.

編輯/張惠娟

The influence of atmospheric fine particles on the expression of EGFR mRNA in mouse skin tissue

HAN Xue1,LIANG Wen-yan2,LIANG Wen-li1,ZHANG Yuan1,SUN Le-dong1
(1.Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou,510282,Guangdong,China;2.College of Environmental Science&Engineering,Beijing 100083,China)

Objective To study the influence of atmospheric fine particles on the expression of EGFR mRNA in mouse skin tissue and to explore the influence of atmospheric fine particles of skin aging. Methods 40 female BALB/c mice were randomly divided into 4 groups including 1 saline control group and 3 PM2.5 exposure groups(1.6,8.0 and 40.0mg/kg body weight,respectively).Each exposure group received intratracheal instillation once per day for 3 consecutive days.At the 24h after the last administration,skin tissueand were collected to detect the expression of EGFR mRNA by realtime fluorescent quantitative PCR.Results Compared with control group,the expression of EGFR mRNA increased significantly in the 8.0 and 40.0mg/kg PM2.5 exposure groups(P<0.05),and positively related to dosage of PM2.5.Conclusion The 8.0 and 40.0mg/kg PM2.5 exposure can induce the expression of EGFR mRNA and promote the occurrence of skin aging.

atmospheric fine particles;epidermal growth factor receptor;Real-Time PCR

Q813.1

A

1008-6455(2015)06-0032-02

孫樂(lè)棟,男,主任醫(yī)師,南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院皮膚科主任;長(zhǎng)期從事抗衰老的臨床和研究工作;

E-mail:sunledong126@126.com

2014-12-16

2015-03-16