徐偉麗，崔鵬舉，魯兆新，張?zhí)m威

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090哈爾濱)

玉米生產(chǎn)加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物玉米麩皮，其得率約為玉米原料量的10%～15%.因此，由玉米麩皮制備的多糖備受關(guān)注.目前，對(duì)于玉米麩皮多糖的研究主要集中于制備方法、降血糖、減肥降脂、抗便秘作用等［1-4］.有研究表明玉米皮多糖還可作為治療結(jié)腸癌的輔助手段［1］，但是還不清楚其確切的分子機(jī)制.本研究探討了玉米麩皮多糖體外對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的抑制作用，為進(jìn)行下一步的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為開發(fā)腫瘤化學(xué)預(yù)防劑和保健食品的新資源奠定了理論基礎(chǔ).同時(shí)，促進(jìn)了玉米加工副產(chǎn)物的深度開發(fā)利用，對(duì)于合理利用糧食資源、全面提高玉米加工產(chǎn)業(yè)的社會(huì)及經(jīng)濟(jì)效益有重要意義.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞購(gòu)自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)所細(xì)胞中心.玉米麩皮多糖:以玉米麩皮為原料，采用超臨界方法去除玉米麩皮中的油脂，采用淀粉酶、蛋白酶去除玉米麩皮中的淀粉、蛋白質(zhì).以水為提取溶劑，提取玉米麩皮多糖，濾液低溫減壓濃縮，醇沉，得水提玉米麩皮多糖.以水提后的水不溶物為原料，分別采用堿液和堿性過(guò)氧化氫溶液為提取劑，中和濾液，低溫減壓濃縮，醇沉，得堿提玉米麩皮多糖和堿性H2O2提玉米麩皮多糖.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

四氮唑藍(lán)(MTT)、RNA 酶、HEPES、DMSO、丙烯酰胺(Sigma Aldrich，美國(guó));L-谷氨酰胺(原平皓公司，中國(guó));RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(Gibco公司，美國(guó));Giemsa Stain(Amresco，美國(guó));其余試劑均為分析純.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

Labo AutoCLAve高壓滅菌器、Program Oven干熱滅菌箱，日本SANYO公司;IX70倒置顯微鏡，日本Olympus公司;ELX800酶標(biāo)儀，Bio-Tek公司;MODEL 5410 CO2培養(yǎng)箱，NAPCO公司.

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

HT-29細(xì)胞在含有1%谷氨酰胺、10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液中，于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，用0.02%EDTA/0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).

對(duì)3種方法得到的玉米麩皮粗多糖(水提、堿提和堿性H2O2提玉米麩皮多糖)進(jìn)行體外抗腫瘤作用研究.將多糖用改良型RPMI-1640培養(yǎng)液分別配制成10 g/L的溶液，0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌，密封并于-20℃下保存，備用，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋到所需質(zhì)量濃度.根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定用于培養(yǎng)人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的水提玉米麩皮多糖為 0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.10 g/L 6個(gè)劑量組，堿提和堿性H2O2提玉米麩皮多糖為0.02，0.10，0.50，2.50，10.00 g/L 5 個(gè)劑量組，腫瘤細(xì)胞加培養(yǎng)液為對(duì)照組.

1.5 細(xì)胞毒性檢測(cè)

細(xì)胞毒性參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行檢測(cè).取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HT-29細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成2.5×104mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞.另設(shè)對(duì)照組.置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，換成含不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的培養(yǎng)液，從加藥第1天起，每天各取1塊96孔板進(jìn)行MTT檢測(cè)，連續(xù)2 d，測(cè)出OD值.檢測(cè)玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制情況及IC50.

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁并達(dá)40%以上融合時(shí)，分別更換含有不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)指定的時(shí)間.在Olympus相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，并進(jìn)行拍照.

1.7 細(xì)胞核分裂指數(shù)

細(xì)胞核分裂指數(shù)參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行檢測(cè).將HT-29細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞，每個(gè)劑量4個(gè)平行孔.細(xì)胞貼壁后，更換含不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的無(wú)血清培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24，48 h后，75%乙醇固定，Giemsa染色(稱Giemsa粉末0.5 g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油33 mL.56℃保溫90～120 min.加入33 mL甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液.按要求用PBS稀釋10倍使用).計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞中所含分裂相的細(xì)胞數(shù)，求出分裂指數(shù)，并與對(duì)照組比較，計(jì)算抑制率.

分裂指數(shù)=分裂細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%;抑制率=(1-給藥組分裂指數(shù)/對(duì)照組分裂指

數(shù))×100%.

1.8 集落形成實(shí)驗(yàn)

集落形成實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)［5］進(jìn)行.常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，將HT-29細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔200個(gè)細(xì)胞，每組4個(gè)平行孔.培養(yǎng)24 h后更換含不同質(zhì)量濃度玉米麩皮多糖的培養(yǎng)液，再分別培養(yǎng)24和48 h后，換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10 d，甲醇固定，Giemsa染色，鏡下計(jì)數(shù)每孔＞50個(gè)細(xì)胞以上的集落數(shù)目，按下式計(jì)算:

集落形成率(%)=(每皿集落數(shù)/每皿接種細(xì)胞數(shù))×100;

集落形成抑制率(%)=(1-加藥組集落形成率/對(duì)照組集落形成率)×100.

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異采用方差分析進(jìn)行處理，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞的毒性作用

采用不同質(zhì)量濃度的玉米麩皮多糖處理HT-29細(xì)胞24和48 h，結(jié)果如圖1～3所示.隨著水提玉米麩皮多糖質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HT-29細(xì)胞的存活率呈下降趨勢(shì)(圖1).0.01 g/L的水提玉米麩皮多糖處理24 h，HT-29細(xì)胞的抑制率為6.9%，0.02 g/L的水提玉米麩皮多糖作用24和48 h對(duì)HT-29細(xì)胞抑制率分別為33.1%和60.6%，24 h的IC50值為0.053 g/L，48 h的IC50值為0.038 g/L.其他兩種多糖處理24和48 h對(duì)HT-29細(xì)胞的毒性作用不顯著(圖2，3).

圖1 水提玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞存活的影響(x±s，n＝5)

圖2 堿提玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞存活的影響(x±s，n＝5)

圖3 堿性H2O2提玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞存活的影響(x±s，n＝5)

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察結(jié)果

采用倒置顯微鏡觀察不同方法獲得的多糖對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，結(jié)果如圖4～6所示.對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞呈菱形或不規(guī)則形，細(xì)胞體積大，生長(zhǎng)緊密，細(xì)胞間隙小(圖4(a));經(jīng)過(guò)水提玉米麩皮多糖處理后，細(xì)胞體積和密度逐漸變小，附壁疏松、變圓.隨著多糖處理時(shí)間的延長(zhǎng)和質(zhì)量濃度的增大，細(xì)胞貼壁能力明顯下降，脫落增加，飄浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞破裂、壞死增多.在低質(zhì)量濃度下(0.02 g/L)處理HT-29細(xì)胞96 h，細(xì)胞克隆形態(tài)多樣，多數(shù)呈團(tuán)塊狀、島狀或巢狀，隨時(shí)間的延長(zhǎng)愈明顯(圖4(b)～(d)).堿提玉米麩皮多糖和堿性H2O2提玉米麩皮多糖 對(duì)HT-29細(xì)胞的抑制作用不明顯，10 g/L處理96 h才表現(xiàn)出抑制作用，細(xì)胞形態(tài)略有變化(圖5(f)和圖6(f)).根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)和形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，后面實(shí)驗(yàn)僅對(duì)水提玉米麩皮多糖進(jìn)行檢測(cè).

圖4 水提玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響(100×)

2.3 細(xì)胞核分裂指數(shù)結(jié)果

細(xì)胞核分裂指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1，不同質(zhì)量濃度的水提玉米麩皮多糖處理24和48 h抑制率分別為9.0%～41.0%和19.8%～67.9%.隨著劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，水提玉米麩皮多糖對(duì)細(xì)胞有絲分裂的抑制作用增強(qiáng).

2.4 細(xì)胞的集落形成結(jié)果

細(xì)胞的集落形成結(jié)果見(jiàn)表2.水提玉米麩皮多糖各劑量組與對(duì)照組相比，對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞集落形成均有抑制作用，且隨劑量的增加抑制作用增強(qiáng).0.1 g/L的水提玉米麩皮多糖作用48 h，集落形成抑制率達(dá)88.1%.該結(jié)果顯示水提玉米麩皮多糖能夠有效抑制HT-29細(xì)胞的集落形成.

圖5 堿提玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響(100×)

圖6 堿性H2O2提玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的影響(100×)

表1 水提玉米麩皮多糖處理對(duì)HT-29細(xì)胞分裂指數(shù)的影響±s，n＝4)

表1 水提玉米麩皮多糖處理對(duì)HT-29細(xì)胞分裂指數(shù)的影響±s，n＝4)

* P＜0.05與對(duì)照組相比.

組別/(g·L-1)癌細(xì)胞有絲分裂數(shù)24 h 48 h分裂指數(shù)/%24 h 48 h抑制率 /%24 h 48 h對(duì)照 556.0±4.7 786.0±3.8 27.8 39.3 — —0.01 506.1±3.2 630.0±4.1 25.3 31.5 9.0 19.8 0.02 434.2±2.7 366.0±3.4* 21.7 18.3 21.9 53.4 0.10 328.0±3.1* 252.3±2.2* 16.4 12.6 41.0 67.9

表2 水提玉米麩皮多糖處理對(duì)HT-29細(xì)胞集落形成能力的影響±s，n＝4)

表2 水提玉米麩皮多糖處理對(duì)HT-29細(xì)胞集落形成能力的影響±s，n＝4)

* P＜0.05與對(duì)照組相比.

組別/(g·L-1)集落數(shù)/孔24 h 48 h集落形成率/%24 h 48 h抑制率/%24 h 48 h對(duì)照 28.5±4.0 29.6±3.3 15.1 15.9 — —0.01 22.0±3.1 18.1±2.1* 11.5 10.1 23.8 36.5 0.02 13.1±2.6* 9.7±1.1* 8.6 6.9 43.0 56.6 0.10 7.6±1.9* 4.6±1.3* 3.1 1.9 79.5 88.1

3 討 論

流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)表明［6-7］:全谷物食品中的多糖可以保護(hù)機(jī)體免受自由基的傷害，還可抵抗一些慢性疾病，如冠心病、糖尿病和癌癥等.大多數(shù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)資料也表明，高纖維膳食可明顯降低結(jié)腸癌的發(fā)病率［8］.各種來(lái)源的纖維素都具有預(yù)防結(jié)腸癌的作用，半纖維素也有抗癌作用，但由于成分較復(fù)雜，目前對(duì)其單一成分的研究報(bào)道不多.玉米多糖包括玉米麩皮、玉米子粒、玉米須和玉米花粉多糖.玉米麩皮多糖因其制備原料豐富而備受關(guān)注，可將其作為保健食品或保健食品原料使用［9］.

目前，關(guān)于玉米麩皮多糖的研究主要集中在提?。?0-11］、純化［12-14］、化學(xué)結(jié)構(gòu)［14-16］及生理活性.國(guó)內(nèi)外的研究已證實(shí)玉米麩皮多糖具有抑制肝損傷、減肥降脂、抗便秘及降血糖等生物活性［1-4］.迄今為止，關(guān)于玉米麩皮多糖對(duì)腫瘤的抑制作用及其機(jī)制的研究均未見(jiàn)報(bào)道.

前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水提玉米麩皮多糖具有良好的抗氧化活性，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，抗氧化性與質(zhì)量濃度呈正相關(guān);本研究中MTT實(shí)驗(yàn)表明，水提玉米麩皮多糖的抗增殖作用與質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，堿提法和堿性H2O2法提取的玉米麩皮多糖對(duì)HT-29細(xì)胞的毒性作用不明顯.HT-29細(xì)胞經(jīng)不同質(zhì)量濃度(0，0.02，0.1，0.5，2.5 和10 g/L)的水提玉米麩皮多糖處理后，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，附壁疏松、變圓，細(xì)胞體積減小;經(jīng)0.1 g/L以及高于此質(zhì)量濃度的多糖處理后的HT-29細(xì)胞，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞脫落增加，飄浮于培養(yǎng)液中，細(xì)胞破裂、壞死增多.細(xì)胞發(fā)生這一系列變化可能與玉米麩皮多糖作用腫瘤細(xì)胞后，引起腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞器和細(xì)胞膜的變化，如線粒體腫脹、糖原合成分泌增加有關(guān).同時(shí)，水提玉米麩皮多糖能夠抑制HT-29細(xì)胞有絲分裂數(shù)和集落形成率，并呈時(shí)間和劑量效應(yīng).綜上，在抗氧化性和抗腫瘤作用方面水提玉米麩皮多糖均優(yōu)于堿提法和堿性H2O2法提取的玉米麩皮多糖，這可能是由于在采用堿和/或堿性H2O2提取的過(guò)程中，多糖的某些功能部分的活性喪失或減弱，因此，擬采用水提玉米皮多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).本研究為下一步對(duì)水提玉米麩皮多糖抑制HT-29細(xì)胞生長(zhǎng)作用機(jī)理的研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

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