李彩東，陳錫蓮，田鵬飛，李惠軍，吳 斌

慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為導(dǎo)致慢性肝損傷的主要原因是機(jī)體免疫調(diào)控紊亂。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（T regulatory cells，Tregs）具有免疫抑制功能，能在自身免疫性疾病、腫瘤免疫、移植免疫[1]發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。Th1/Th2細(xì)胞失衡可能是HBV感染慢性化的機(jī)制之一[3]。因此，針對(duì)慢性乙型肝炎患者Th1和Th2類(lèi)細(xì)胞因子的研究也是慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。Th1型細(xì)胞因子主要有白細(xì)胞介素-18（Interleukin-18，IL-18）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）等，Th2型細(xì)胞因子有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β（Transforming growth factor-β，TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）等[4]。本研究旨在探討 HBV 感染者外周血 CD4+CD25+Treg及 IL-18、IFN-γ、TGF-β 水平的變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例來(lái)源 2012年7月～2012年12月我院門(mén)診和住院收治的慢性乙型肝炎（CHB）患者63例，男性30例，女性33例；年齡21～57歲，平均年齡（37.28±12.08）歲。HBV攜帶者（ASC）112例，男性69例，女性43例；年齡28～63歲，平均年齡（41.45±13.17）歲。診斷符合2010年12月中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)會(huì)和感染病學(xué)會(huì)聯(lián)合修定的慢性乙型肝炎防治指南[5]的標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均未接受過(guò)免疫調(diào)節(jié)和抗病毒治療，6個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)保肝治療。排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染，排除自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、藥物性肝損傷。另選擇同期門(mén)診健康體檢者50例，男性25例，女性25例；年齡23～58歲，平均年齡（38.6±13.1）歲，排除各型肝炎病毒感染，排除心肺疾病，肝功能正常。

1.2 外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè) 空腹取外周血2 ml，乙二胺四乙酸二鉀（EDTAK2）抗凝，在樣品測(cè)定管中加入抗凝血50μl，加入抗CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP單克隆抗體20μl（購(gòu)自美國(guó)Bectond-Dickinson公司），振蕩混勻，室溫避光孵育20 min，加入溶血素2 ml，振蕩混勻，室溫避光放置15 min。1500 r/m離心5 min，棄上清液。加入PBS 2 ml，1500 r/m離心5 min，棄上清液，重復(fù)一次。加入PBS 500μl，上機(jī)（FACSV Verse流式細(xì)胞分析儀，美國(guó)Becton-Dickinson公司）檢測(cè)。全部數(shù)據(jù)用流式細(xì)胞儀和BD FAC Suite軟件系統(tǒng)進(jìn)行熒光參數(shù)獲取和分析。

1.3 血清IL-18、IFN-γ和TGF-β檢測(cè) 采用 ELISA法檢測(cè)（美國(guó)R＆D公司），使用ST-360型酶標(biāo)儀（上?？迫A）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的OD450值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出標(biāo)準(zhǔn)方程，然后換算出每個(gè)待測(cè)標(biāo)本細(xì)胞因子水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以（）表示，采用 t檢驗(yàn)和 Pearson相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢性HBV感染者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及其細(xì)胞因子水平變化 見(jiàn)表1。

表1 3組人群外周血CD4+CD25+Treg(%)和細(xì)胞因子水平（ng/ml，）比較

表1 3組人群外周血CD4+CD25+Treg(%)和細(xì)胞因子水平（ng/ml，）比較

與健康人比，①P<0.01；②P<0.05

例數(shù) Treg細(xì)胞 IL-18 IFN-γ TGF-β健康人 50 27.30±17.59 49.79±25.68 14.41±11.75 42.28±17.50 ASC 112 28.17±18.52 524.52±81.42 204.93±47.77 336.01±82.61 CHB 63 30.97±18.78 448.51±75.75 190.93±38.52 331.22±71.67

2.2 不同HBV感染者肝功能和HBV DNA水平比較 見(jiàn)表2。

表2 3組人群肝功能和HBV DNA水平（）比較

表2 3組人群肝功能和HBV DNA水平（）比較

與健康人比，①P<0.01；②P<0.05

例數(shù) ALT（U/L） AST（U/L） TBIL（μmol/L） HBV DNA（lg IU/ml）健康人 50 19.90±3.95 15.38±2.68 13.67±2.30 -ASC 112 26.29±9.18 32.18±15.42 27.82±62.07 2.81±2.85 CHB 63 269.39±38.55 210.35±30.97 65.85±92.34 5.49±1.99

2.3 不同HBV DNA載量ASC人群外周血CD4+CD25+Treg和細(xì)胞因子水平比較 見(jiàn)表3。

表3 不同HBV DNA載量ASC外周血CD4+CD25+Treg和細(xì)胞因子

2.4 不同HBV DNA載量CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和細(xì)胞因子水平比較 見(jiàn)表4。

表4 不同HBV DNA水平CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和細(xì)胞因子水平（）比較

表4 不同HBV DNA水平CHB患者外周血CD4+CD25+Treg和細(xì)胞因子水平（）比較

與其他兩組比，①P<0.01；與中水平組比，②P<0.05，與低水平組比，P<0.01

HBV DNA載量例數(shù)CD4+CD25+（%）IL-18（ng/ml）IFN-γ（ng/ml）TGF-β（ng/ml）高水平 18 32.45±17.45 44.79±25.68 24.82±7.92 48.01±0.58中水平 19 30.56±18.59 40.52±17.76 23.13±8.25 44.45±0.76低水平 26 30.86±19.03 41.22±18.98 20.05±9.51 41.41±0.63

3 討論

CD4+CD25+Treg是一群起負(fù)性調(diào)節(jié)的免疫抑制性T細(xì)胞，在外周血中約占CD4+T淋巴細(xì)胞的5%～10%，在1995年由Sakaguchi et al首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道。大量研究證實(shí)，CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量減少及其免疫功能受損與機(jī)體自身免疫性疾病的發(fā)生關(guān)系密切。目前，許多學(xué)者認(rèn)為CD4+CD25+Treg可抑制HBV抗原特異性T細(xì)胞，與慢性乙型肝炎的慢性化相關(guān)[7]。細(xì)胞因子作為宿主對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的重要免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，在宿主清除病毒的免疫應(yīng)答和抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞因子、CD4+CD25+Treg和Th1/Th2細(xì)胞失衡，都可引起免疫系統(tǒng)的異常，導(dǎo)致乙型肝炎慢性化。因此，細(xì)胞因子作為宿主對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的重要免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)，在宿主清除HBV的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。讓我們感興趣的是慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg及細(xì)胞因子IL-18、IFN-γ、TGF-β水平與HBV DNA載量之間是否存在聯(lián)系，我們能否通過(guò)研究?jī)烧咧g的關(guān)系，為治療乙型肝炎提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，乙型肝炎病毒攜帶者和慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg均升高，但CHB組患者CD4+CD25+Treg顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），證實(shí)慢性乙型肝炎患者CD4+CD25+Treg百分?jǐn)?shù)較正常人升高。HBV特異性CD4+CD25+Treg細(xì)胞的存在可能抑制HBV特異性免疫應(yīng)答，使得機(jī)體無(wú)法充分清除病毒，從而導(dǎo)致持續(xù)感染。我們還發(fā)現(xiàn)CHB患者較ASC外周血CD4+CD25+Treg升高，提示慢性HBV感染過(guò)程中宿主出現(xiàn)過(guò)度的免疫病理?yè)p傷和炎癥反應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞被不同程度激活，CD4+T細(xì)胞分化為CD4+CD25+Treg細(xì)胞增多，從而使CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量增加，表明 CD4+CD25+Treg細(xì)胞參與了慢性乙型肝炎的發(fā)病過(guò)程。

CD4+CD25+Treg細(xì)胞是一種免疫抑制細(xì)胞，它的增加是否與這類(lèi)患者難以清除HBV有關(guān)？本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組和ASC組CD4+CD25+Treg與HBV DNA載量有關(guān)，與Stoop et al的報(bào)道相一致。病毒復(fù)制越活躍的患者體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例越高，說(shuō)明機(jī)體可能通過(guò)Treg的免疫抑制效應(yīng)促進(jìn)了病毒的復(fù)制，提示Treg在慢性乙型肝炎的免疫耐受中起一定的作用，CD4+CD25+Treg升高也可能是慢乙型肝炎患者難以清除乙型肝炎病毒的因素之一。

本研究共選取慢性乙型肝炎患者63例、HBV攜帶者112例和健康對(duì)照組50例，對(duì)其外周血IL-18、IFN-γ、TGF-β水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，ASC組和CHB組患者外周血IL-18、IFN-γ、TGF-β水平均顯著高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。CD4+CD25+Treg能夠分泌細(xì)胞因子TGF-β，其水平升高提示CD4+CD25+Treg作為抑制性免疫細(xì)胞，通過(guò)分泌TGF-β，下調(diào)免疫功能，抑制CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活化，阻礙HBV的清除，導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的發(fā)生和發(fā)展。IL-18能促進(jìn)T細(xì)胞增殖產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)Th1類(lèi)反應(yīng)，提示Th1占優(yōu)勢(shì)，機(jī)體以細(xì)胞免疫為主，細(xì)胞免疫功能受到抑制，出現(xiàn)Th1/Th2的失衡。

本研究結(jié)果在一定程度上提示CD4+CD25+Treg和部分細(xì)胞因子參與了乙型肝炎發(fā)病的慢性化過(guò)程，這對(duì)進(jìn)一步研究其在慢性乙型肝炎患者發(fā)病機(jī)制中的作用，為以CD4+CD25+Treg和細(xì)胞因子作為治療靶點(diǎn)的策略提供了新的思路和方法。

[1]莊勤建，邱隆敏，姚新生，等.CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與乙型肝炎病毒感染的研究進(jìn)展.世界華人消化雜志，2012，20（24）:2248-2253.

[2]吳銀亞，譚善忠.CD4＋CD25＋調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞在慢性乙型肝炎發(fā)病機(jī)制中的作用. 中華傳染病雜志，2012，30（9）：563-565.

[3]孫學(xué)華，劉巧麗，李曼，等.慢性乙型肝炎患者CD4+和CD8+T細(xì)胞亞群的研究. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（5）：545-547.

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